48例肥大细胞瘤患犬不同治疗方案比较研究

李家骥，张兆霞，杨紫嫣，李格宾

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

48例肥大细胞瘤患犬不同治疗方案比较研究

李家骥，张兆霞，杨紫嫣，李格宾*

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

肥大细胞瘤是犬最常见的皮肤肿瘤，因其恶性率和转移率都较高，在临床治疗中需要谨慎选择治疗方案以达到更好的治疗效果。从治疗效果、生存期、药物副反应等几个方面对采取不同治疗方法的48例皮肤肥大细胞瘤患犬进行分析，着重讨论了分子靶点药物治疗c-kit基因突变肥大细胞瘤患犬的治疗效果,以期为我国小动物临床犬肥大细胞瘤的治疗提供一定的参考。

犬肥大细胞瘤；化疗；分子靶点药物；伊马替尼

肥大细胞瘤(Mast cell tumor,MCT)是犬最常发的皮肤肿瘤[1]。常用的治疗方法一般为手术切除[2]，但对于不能确定手术边界或已发生转移的病例则需要联合放疗或化疗药物进行治疗。放疗由于其设备价格昂贵，目前在国内尚不能作为常规治疗手段。而传统的化疗药物如长春花碱、洛莫司汀则存在副作用大、效率差等缺点[3-7]。近些年随着人类医学中“精准医疗”这一概念的提出及推广，以及London C A等[8]和Ma Y等[9]发现了犬MCT也具有c-kit基因突变的发病机制后[8-9]，在兽医领域对分子靶点药物——酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的研究也急剧增多。TKI可以靶向作用于BCr-Abl融合基因、kit蛋白、血小板衍生生长因子受体(platelet-derived growth factor receptor，PDGFR)等[10-12]，在医学领域多用于治疗胃肠道间质瘤(Gastrointestinalstromal tumor，GIST)或慢性髓细胞白血病(Chronic myelocytic leukemia，CML)等[13-14]，同时可用来治疗c-kit基因突变的MCT。其中托赛拉尼(Toceranib，SU11654，商品名：Palladia○R，Pfizer)和马赛替尼(Masitinib，商品名Kinavet○R，AB Science)在欧美已应用于小动物临床多年[15-16]，而甲磺酸伊马替尼(Imatinib，商品名：格列卫Gleevec○R，Novartis)作为一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，可以和ATP竞争酪氨酸激酶蛋白上的ATP结合位点，并阻止下游信号转导，破坏c-kit基因突变的肥大细胞的自动磷酸化，从而抑制生长失控的肥大细胞[17]。犬皮肤MCT的c-kit基因突变率为30%左右，其中最常见的突变类型是位于kit蛋白近膜区域中外显子11的内部序列重复突变(internal tandem duplication，ITD)，突变率9%～17%[18-21]。因此，对于具有c-kit基因突变的肥大细胞，分子靶点药物可以精准杀伤肿瘤细胞，而减少对机体正常细胞的损伤，从而大幅度提高患犬的生活质量。在中国目前尚无关于犬MCT治疗的研究报告，本研究将对48例采取的不同治疗方案的MCT患犬进行比较，并评估伊马替尼对犬皮肤MCT的治疗效果及药物副作用。

1 材料与方法

1.1 材料

2015年9月至2016年12月前来中国农业大学动物医院就诊的MCT患犬48例。其中金毛寻回犬9只，杂种犬8只，贵宾犬和雪纳瑞犬各5只，吉娃娃犬和巴哥犬各4只，其余品种13只。平均年龄为11岁(3岁～16岁)，23只雌性(5只已绝育)，25只雄性(7只已去势)。所有犬在皮肤上均有明显的肿物。肿物大小按照RECIST[22]标准进行测量，即测量肿物的最大直径。肿物平均大小为5.5 cm(范围0.75 cm～15.7 cm)。

通过病理组织学检查或细胞学检查对肿块进行诊断。组织病理学应用Patnaik分级方法，并且对引流区域增大的淋巴结进行穿刺，判断是否有淋巴结转移，腹部B超进行肝脏和脾脏的转移排查，综合各项临床指标进行临床分期。

48例患犬中的11只在诊断后采用了分子靶点药物的治疗，平均用药时间为53 d(6 d～161 d)。其中8只使用了伊马替尼，1只使用马赛替尼，2只使用托塞拉尼。其余37只患犬中，2只使用长春花碱治疗，10只采取了单独手术治疗，21只保守治疗(泼尼松维持)，4只在诊断为MCT后动物主人选择将患犬实施安乐死。

1.2 方法

1.2.1 突变检测 细针抽吸采集肿瘤细胞后置于1.5 mL生理盐水中，提取细胞DNA，参照文献[23]中的操作方法进行PCR检测。将PCR扩增产物测序后与NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载的各段外显子基因序列及氨基酸序列进行对比，如氨基酸发生变化则判断为有效突变。

1.2.2 治疗及反应评估 伊马替尼的给药剂量为每天5 mg/kg～10 mg/kg；托塞拉尼的剂量为3.25 mg/kg，每隔1 d给药1次；马赛替尼的给药剂量为每天12.5 mg/kg。由于肥大细胞分泌的组胺和五羟色胺会造成一些患犬出现呕吐、肿物周围水肿、破溃等症状，在给予化疗药的同时，给一些抗过敏药物和保护胃肠道的药物，如苯海拉明、法莫替丁或奥美拉唑等。MCT对分子靶点药物的反应用RECIST标准进行测量。采用以下评价标准：完全缓解(complete remission,CR)：所有靶病灶消失，无新病灶出现；部分缓解(partial remission，PR)：靶病灶最大直径之和减少≥30%，至少维持4周；疾病稳定(stable disease，SD)：靶病灶最大径之和缩小未达PR，或增大未达PD；疾病进展(progressive disease，PD)：靶病灶最大径之和至少增大≥20%，或出现新病灶。不良反应的评估即对所有化疗患犬在用药后的第7天、第14天及之后定期进行体格检查、血常规及生化检查，并根据VCOG-CTCAE评价标准进行评价[24]。

2 结果

在48例纳入试验的犬中，肿物平均大小为5.5 cm(范围0.75 cm～15.7 cm)。肿物位置按照躯干、四肢、头颈和其他四个部位来区分，其中躯干部位占27%，四肢占41.7%，头颈部位占22.9%，其他为8.3%。42例犬为单发病灶，6例为多发病灶。7例犬手术切除后进行了病理分级：3例为Ⅰ级，3例为Ⅱ级(其中两例患犬具有c-kit基因突变)，1例为Ⅲ级(具有c-kit基因突变)。剩余41例犬仅进行了细胞学检查，无法确定其病理分级。在进行了淋巴结穿刺的16例犬中，有12例可见大量肥大细胞，提示已经发生淋巴结转移。根据MCT的WHO分期标准，0期和Ⅰ期患犬共23例，Ⅱ期患犬12例，Ⅲ期患犬6例，Ⅳ期患犬8例。

PCR检测c-kit基因突变情况，可见有7例患犬出现外显子11的ITD突变，突变率为14.6%。

2.1 对分子靶点药物的反应

在使用分子靶点药物治疗的11例患犬中，有5例发生了外显子11的ITD突变，分别是2、23、29、31、48号病例，使用了伊马替尼后均在第7或第14天内达到部分缓解。其中48号病例在使用了7 d后达到了部分缓解，在用药21 d后达到手术范围进行手术切除，且至目前没有复发；其余4例在平均用药119 d后(65 d～161 d)对分子靶点药物产生耐药性，其中2号病例用药97 d后复发，并于复发后40 d死亡；23号病例用药161 d后复发，复发后尝试使用托塞拉尼治疗，但没有起效，于复发后68 d死亡。29号病例在用药后65 d复发，主人放弃治疗，最终于复发后88 d死亡。31号病例在肿物停止缩小后扩大手术切除范围，至目前患犬健康且没有复发。其余没有突变而使用了分子靶点药物的6个病例中，5、8、33号病例使用了伊马替尼，均没有明显效果，5号病例为SD，8号及33号为PD，并分别在就诊后的56、54、38 d死亡。14号病例使用了多靶点药物马赛替尼，达到PR水平，并在肿物缩小后配合手术治疗，目前未出现复发或远端转移。24号病例使用托塞拉尼，达到CR水平，目前患犬健康；而38号病例使用托塞拉尼的同时给予泼尼松治疗，初期肿物略有缩小，很快肿物增大，并于就诊后的88 d死亡。

2.2 对普通化疗药的反应

有2例患犬由于没有c-kit基因的突变，而选择了用常规化疗药物长春花碱治疗。分别在治疗后的第14天(43号病例)和第21天(45号病例)内肿物缩小达PR水平，但分别在用药后第5周和第4周肿物停止缩小，在停止缩小后选择手术切除，目前患犬健康。化疗药物使用情况及其使用效果见表1。

2.3 不同治疗方法生存期比较

按不同治疗方法，将病例分为保守治疗、单独化疗、单独手术治疗、化疗联合手术治疗4组。保守治疗组的中位生存期(median survival time，MST)仅为48 d；采取分子靶点药物治疗的病例中，未突变病例的MST为88 d，突变病例的MST为153 d；化疗后联合手术切除的4例患犬目前仍存活，从初诊至目前总天数分别为403、253、83、70 d；而采取单独手术治疗的患犬中，3号和26号病例分别在术后87 d和120 d死亡，其他病例至目前仍存活。

表1 化疗药物使用情况及治疗效果评价Table 1 Evaluation of the use of chemotherapy drugs and therapeutic efficacy

注：“-”表示至目前患犬仍存活。
Note："-"Indicate the dog is still alive.

2.4 分子靶点药物与普通化疗药物的副作用评价

药物的副作用根据VCOG-CTCAE评价标准进行评价。在使用伊马替尼治疗的8个病例中，最常见的副反应为轻微胃肠道反应，在用药初期出现呕吐、软便等情况，但这些症状在对症治疗后得到缓解。血液学检查方面，23号病例在用药治疗1周后出现轻度贫血，但在用药2个月后血象逐渐恢复正常。肝肾指标方面，31号病例由于发生了肝脏转移，在用药前肝脏指标高于正常范围，但在用药后肝脏指标逐渐恢复正常；在使用长春花碱的病例中，因为长春花碱主要从肝脏代谢，43号病例在用药后出现了严重肝脏指标升高的情况。此外使用长春花碱治疗的43号和45号病例均出现轻微贫血。具体副反应、出现的病例数及分级见表2。

表2 伊马替尼与长春花碱副反应评价Table 2 Evaluation of side effects of imatinib and vinblastine

3 讨论

从本研究的数据来看，在化疗药物对患犬的治疗效果方面，TKIs对有c-kit基因突变的患犬具有较好疗效，一般均可在用药后的1周～2周内达到PR或CR水平，在起效时间和药物副反应方面要优于长春花碱。而没有c-kit基因突变的患犬，有个别犬具有完全或部分缓解效果，推测可能是由于以下原因:①除exon11的ITD突变外，还有可能存在点突变、缺失突变等，在本研究中只检测了exon8、9、11，而在整个kit蛋白中，存在21个外显子区域，所以可能是其他外显子区域发生了突变[20-21]。②有相关研究报道指出，除c-kit基因的突变，还有可能存在其他一些自动磷酸化的机制，如在人的肥大细胞增多症中出现PDGRF-α或PDGFR-β的突变[25-26]或其他酪氨酸激酶受体的突变。有文献报道，TKIs具有药物累积作用，有些没有突变的患犬在用药6周～9周后才逐渐起效[27]，但本试验一些病例由于主人经济原因，在用药后不见效的情况下即停止给药，所以不清楚分子靶点药物是否能对一些未突变患犬起效。有文献提到将托塞拉尼、泼尼松和放疗联合应用比单用托塞拉尼效果好[28]，但因国内没有放疗，所以在本研究中也无法进行比较。

在生存期方面，从本研究数据可以看出，对于可以完全切除的患犬，术后生存期较长，生活质量较高；而若盲目手术，不能达到MCT要求的3 cm边界，肿瘤复发及转移几率非常高，而且由于肥大细胞释放的组胺，使手术创口不易愈合；特别是如果术前已经发生转移的病例，手术反而会导致动物应激，加速肿瘤生长，导致生活质量很差且生存期很短。Takeuchi Y等[21]通过统计患犬病理分级结果及c-kit基因突变情况及跟踪生存期后指出，发生c-kit基因突变的MCT患犬，无进展生存期(progression-free survival，PFS)相对较短，因此c-kit基因突变检测还可以作为患犬PFS的一个预测指标。有研究显示c-kit基因突变与Patnaik Ⅲ级或Kiupel高等级的MCT具有一定相关性，说明病理分级越高，也就是肿瘤的恶性程度越高，越可能出现c-kit基因突变。在本研究中只采用了Patnaik分级方法。对有c-kit基因突变的患犬在使用分子靶点药物治疗之后，其总生存期较保守治疗和未突变患犬均有明显延长，且化疗后肿物缩小，如配合手术治疗，可使患犬具有较好的生活质量和较长生存期。

对于伊马替尼的副作用，Bonkobara M[29]通过对相关文献总结发现，大部分以胃肠道反应为主，如呕吐、腹泻、食欲不振等，有一部分患犬存在肝脏指标升高的情况。从本研究数据来看，每天给予5 mg/kg～10 mg/kg，其带来的副作用基本与文献所述一致，大部分为Ⅰ级胃肠道反应。而与之相比，使用长春花碱的患犬出现了严重贫血及肝脏指标升高的情况。Burton J H等[30]的研究表明，若将托塞拉尼与洛莫司汀联合用药可作为一种新的治疗方案，以减少单独使用两种药物时的副作用。

本研究还有许多不足之处：①对患犬的全面临床评估不是很充分。由于目前大多数动物主人还不能够完全接受活检取样，所以许多病例在术前都没有做病理分级，导致病理分级与c-kit基因突变及临床生物学特征的关系在本文中证据还不足。②由于使用长春花碱治疗的病例数量较少，对生存期及治疗效果和副反应评估方面受到一定的局限性，仍需要一个更大样本量的数据统计进行评估。③有一些患犬为转诊病例，或肿瘤过大，炎症水肿非常严重，在就诊初期使用了泼尼松治疗，虽然用药期间肿物未见明显缩小，但仍为一个干扰因素。④由于至目前仍存活患犬占一定比例，所以在本文中对生存期的统计采取中位生存期而非总生存期或无进展生存期。⑤本试验中只对外显子8、9、11进行检测，在今后的研究中可以增加对其他位点的检测，以提高突变检出率。

总体来说，分子靶点药物对c-kit基因突变患犬治疗效果明显。然而分子靶点药物费用较昂贵，通过检测c-kit基因突变，可以预测该病例对分子靶点药物的反应，减少无谓的给药和浪费，及早选择更有效的药物。通过分子靶点药物的治疗，患犬生存期较保守治疗患犬有明显延长；而与传统化疗药物相比，分子靶点药物副作用相对较轻，患犬生活质量有很大提高。因手术是皮肤MCT的唯一根治方法，如果在使用化疗药物使肿物缩小后配合手术治疗，可以达到很好的治疗效果。本研究为临床兽医提供了很多有实际参考价值的数据，希望今后更多的MCT患犬能在保证良好生活质量的基础上有更长的生存期。

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ComparativeStudyofDifferentTreatmentin48DogswithMastCellTumor

LI Jia-ji,ZHANG Zhao-xia,YANG Zi-yan,LI Ge-bin

(CollegeofVeterinaryMedcine,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100193,China)

Mast cell tumor (MCT) is the most common skin tumor in dogs,because of its high rate of malignancy and metastasis,the clinical treatment method need to be carefully selected to achieve better outcome.This study compared 48 dogs with cutaneous MCTs treated by different therapeutic regimens,which from the therapeutic efficacy,survival time,drug side effects and other aspects.This research also discussed the molecular target drug therapy on c-kit gene mutation MCT dogs.These results will be beneficial to the scientific researchers and small animal clinical practitioners in China.

canine mast cell tumor;chemotherapy;molecular target drug;imatinib

2017-02-05

中国农业大学基本科研业务费专项资金项目(2017QC081)

李家骥(1993-)，女，北京人，硕士研究生，主要从事小动物肿瘤学研究。*

S857.4;S858.292

B

1007-5038(2017)10-0127-05