黑熊线粒体12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艳 王 妍鞠 铭

(延边大学农学院，延吉，133000)稿件运行过程

黑熊线粒体12S rRNA基因的克隆及序列分析研究

袁昕慧 袁慧艳 王 妍1鞠 铭

(延边大学农学院，延吉，133000)稿件运行过程

东北亚种黑熊；12S rRNA；克隆；序列分析

为了解东北长白山黑熊线粒体基因的遗传学特点，本研究利用已报道的部分熊科动物的线粒体基因的保守序列。本文采用PCR技术，首次从延边圈养的黑熊的全血总DNA中扩增出了线粒体12S rRNA基因，基因长度为967 bp。将PCR产物纯化回收后克隆于 pMD18-T Vector，成功构建了重组克隆质粒。并与已报道的四川黑熊、日本黑熊进行了序列比较分析，结果表明，长白山黑熊与四川黑熊的亲缘关系比较近，在序列上具有较高的相似性。该研究为长白山黑熊遗传物种鉴定和多样性研究提供了重要的参考依据，也为更深入的研究亚洲黑熊分子生物学提供了重要的参考。

熊科(Ursidae)动物世界上共有6个属(不含大熊猫Ailuropodamelanoleuca)，中国有3个属，即棕熊属(Ursus)，黑熊属(Selenarctos)和马来熊属(Helarctos)。黑熊属中，我国的为亚洲黑熊(Selenarctosthibetanus)，被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅰ、国家Ⅱ级保护野生动物及《中国濒危动物红皮书》物种 Ⅴ 中，该种全部分布于亚洲，共分 8 个亚种，中国有5个亚种，即指名亚种(S.t.thibetanus)、喜马拉雅亚种(S.t.laniger)、四川亚种(S.t.mupinensis)、台湾亚种(S.t.formosanus)、东北亚种(S.t.ussuricus)[1-3]。延边地区位于吉林省东南部，是黑熊资源比较丰富的地区。目前人工养殖数达3 147头，占全国养殖数的27.4%[4]，圈养的黑熊来源多为长白山野生黑熊繁殖而来。

多年来，国内外的相关学者和专家从不同学科不同领域对黑熊进行了广泛而深入的研究，已经在美洲熊类基因组方面做了广泛的研究，此外对大熊猫的研究也持续进行着[4-8]，国内亚洲黑熊也逐渐成为研究重点，研究报道陆续出现，如血型检测、染色体组型分析、COI序列变异及其DNA条码的应用等[9]；在亚洲黑熊四川亚种方面有线粒体 DNA cytb基因、ND3_ND4L和tRNA_Arg基因、细胞色素 C氧化酶亚基Ⅰ基因、ATP 8和ATP 6序列分析等基因组的序列研究[10-17]，但在东北长白山黑熊除了流行病学调查、黑熊基因 DNA 中部分微卫星位点的探讨等小数量的文献可查，线粒体基因的研究还未见报道。但是，以这些卓有成效的研究为参考，我们利用哺乳动物线粒体基因的保守序列设计引物，通过 PCR 克隆技术对东北亚黑熊线粒体的12S rRNA 基因进行克隆、测序，并分析其序列特点，为长白山黑熊的遗传特点及多样性分析研究提供了基础资料，也为其他物种线粒体基因的研究提供了可靠的依据与科学参考。

1 材料与方法

1.1 样本

所用材料为东北黑熊的全血，取自吉林省延边朝鲜族自治州地区3家黑熊养殖场(20只东北黑熊的血液样本)。

1.2 载体与主要试剂

质粒pMD 18-T Vector、Trans5a 大肠杆菌感受态细胞、PCR 试剂和所用的Taq酶购自Takara工程有限公司；胶回收试剂盒购自大连宝生物。

1.3 方法引物设计与合成

根据已报道的美洲黑熊(Ursusamericanus)、棕熊(Ursusarctos)和北极熊(Ursusmaritimus)(登录号依次分别为：AF303109，AF303110，AF303111)的12S rRNA基因序列，我们设计了引物来扩增东北黑熊的12S rRNA基因(引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)，其引物如下：

12S-F，5-CAAAGGTTTGGTCCTGGCCTTCCTA-3；12S-R，5-GTTTATCCAAGCACACTTTCCAGTA-3。

1.4 东北亚种黑熊线粒体12S rRNA基因的扩增与鉴定

应用基因组DNA提取试剂盒提取黑熊血液中线粒体基因组DNA，并以此为模板分别进行PCR扩增，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。

PCR反应体系 50 μL，含dNTPs 0.2 mmol/L，MgCl21.5 mmol/L，ExTaqDNA聚合酶 2.5 U，DNA 提取物2μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性 5 min，然后95 ℃变性 1 min，退火温度60 ℃ 1 min，72 ℃延伸 2 min，35个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。

1.5 东北亚种黑熊线粒体12S rRNA基因的克隆与鉴定

将纯化的东北亚种黑熊线粒体12S rRNA目的基因片段与pMD18-T Vector 连接，转化至Trans5a感受态细胞，经氨苄青霉素 LB 平板筛选阳性克隆重组菌。用小量质粒提取试剂盒提取重组克隆质粒，进行PCR鉴定和EoR I、Sell I 双酶切鉴定。

1.6 东北亚种黑熊线粒体12S rRNA基因的序列推导与分析

将PCR鉴定和EoR I、Sell I 双酶切鉴定为阳性的对应菌液由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行测序分析，并应用生物学软件DNA star 与NCBI 上发表的序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 东北亚黑熊线粒体12S rRNA 基因的扩增

12S rRNA 的预期目的片段长度为967 bp，黑熊样本扩增产物12S rRNA正介于750～1 000之间(图1)，与预期结果大小一致，说明 PCR 扩增成功。

图1 PCR扩增结果Fig.1 Results of PCR amplification注：M.DL 2000 DNA marker；1～2.PCR扩增12S rRNA产物；3.PCR阴性对照Note：M.DL 2000 DNA marker；1-2.PCR amplification of 12S rRNA；3.Negative control

2.2 东北亚黑熊线粒体12S rRNA 基因克隆结果鉴定

克隆后，取菌液2μL进行PCR 扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：所得条带大小分别在967 bp左右(图2)，与预期结果一致，说明克隆成功；将经过PCR 鉴定为阳性的重组质粒，分别应用EoR I、Sell I 进行双酶切。经琼脂糖凝胶电泳检测结果显示：分别获得大小为2 692 bp多和967 bp的条带(图3)，说明重组质粒中均含有目的基因。

图2 克隆的PCR鉴定结果Fig.2 Results of clone identification by PCR注：M.DL 2000 DNA marker；1～5.黑熊样本的克隆；6.PCR阴性对照 Note：M.DL 2000 DNA marker；1～5.Clone of black bear’s sample；6.Negative control

图3 双酶切鉴定结果Fig.3 Enzyme digestion identification注：M.DL 2000 DNA marker；1.PCR阴性对照；2～6.双酶切产物Note：M. DL 2000 DNA marker；1.Negative control；2～6.Product of enzyme digestion

2.3 东北亚黑熊线粒体12S rRNA 基因测序结果

克隆的东北亚黑熊线粒体12S rRNA基因经英潍捷基(上海)贸易有限公司测定，东北亚黑熊线粒体

12S rRNA基因序列长度为967 bp，将GenBank中发表的美洲黑熊(Ursusamericanus)、眼镜熊(Tremarctosornatus)、大熊猫、四川黑熊和狗(Canislupusfamiliaris)的12S rRNA与其进行比较，分析结果表明：与GenBank中发表的四川黑熊(DQ402478)12S rRNA基因的同源性最高，为98.7%(表1)，对角线以上为同源性比较，对角线以下为距离矩阵。利用MEGA 5.05 生成进化树，东北黑熊与四川黑熊的Bootstrap值为91，可以认为这个分支是可靠的(图4)。

本次测出的黑熊12S rRNA序列含341 个A，占35.30%；183 个G，占18.94%；224 个T，占23.19%；218 个C，占22.57%，G+C 含量为41.51%(图5)。

图4 6个物种12S rRNA的进化树Fig.4 Phylogenetic tree of 12S rRNA gene from six species注：12S-19-2：亚洲东北黑熊；AF303109：美洲黑熊；AY390363：大熊猫；AY729880：狗；DQ402478：亚洲黑熊四川亚种；L21883：眼镜熊Note：12S-19-2：S.t.ussuricus；AF303109：Ursus americanus；AY390363：Ailuropoda melanoleuca；AY729880：Canis familiaris；DQ402478：S.t.mupinensis；L21883：Tremarctos ornatus

表1 6个物种的12S rRNA基因同源性比较结果

Tab.1 Homology comparison of 12S rRNA gene from six species

注：*为同源性最高的一组数值

Note：*The highest homology of a set of values

图5 6个物种的序列比较Fig.5 Sequence comparison of 12S rRNA from six species

3 讨论

我们根据已报道部分黑熊各亚种的线粒体基因组的信息设计了1对引物，成功扩增出了东北亚种黑熊长白山黑熊的线粒体12S rRNA基因序列，并成功构建了该基因的克隆载体，经序列测定分析，结果显示，我们所扩增的基因序列与已报道的四川黑熊12S rRNA基因序列同源性高达98.7%，聚类于同一支，说明东北黑熊与四川黑熊亲缘关系更接近。发现东北黑熊12S rRNA与四川黑熊基因全序列共有12个位点呈现变异，8个位点是转换，占变异总数的66.7%，其中有4个C↔T转换，占总转换位点的50%；A↔G转换有4个，占总转换位点的50%，无颠换位点。此外，有1处碱基缺失，为A 缺失；3处碱基增添，为2个A 插入和1个T 插入。

东北黑熊12S rRNA与美洲黑熊基因序列相比共有41个位点变异，其中36个位点是转换，A↔G转换有20个，占总转换位点的55.6%，C↔T转换有16个，占总转换位点的44.4%；1个位点为A↔T颠换。此外，有1处碱基缺失和3处碱基插入。

为保证实验结果的准确与可靠，实验分4次对圈养的黑熊进行采血并提取其总DNA，每次提取5支，并对提取的DNA进行3次的PCR扩增与鉴定，最终选取最为理想的扩增产物进行测序比对，所获得的结果相同，证明了本实验的准确性与可靠性。

本实验首次成功克隆出东北黑熊的线粒体12S rRNA的序列，并对其进行了初步的分析，填补本研究领域一项空白的同时也为探究黑熊线粒体基因组的遗传特点、物种进化关系及物种多样性分析提供了科学参考。

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Black bear；12S rRNA；Cloning；Sequence analysis

Cloning and Sequence Analysis of 12S rRNA Gene of Mitochondria of Asian Black Bear (Selenarctos thibetanus ussuricus)

Yuan Xinhui Yuan Huiyan Wang Yan*Ju Ming

(College of Agriculture，Yanbian University，Yanji，133000，China)

To understand the genetic characteristics of mitochondrial DNA of black bears at Changbai Mountain in northeast China，we designed primers according to published mitochondrial DNA sequences of some ursidae species.We amplified 12S rRNA genes by PCR method for the first time from the whole blood of captive black bears in Yanbian.The amplicon was purified，cloned into pMD18-T vector and sequenced.A 967 bp sequence of 12S rRNA was obtained.We compared the obtained sequences with published sequences of Sichuan and Japan black bears.Results showed that black bears at Changbai mountain have closer genetic relationships and high similarity in sequence with Sichuan black bears.Our results provide a reference for bear species identification，for study of the genetic diversity of the Changbai Mountain ecosystem，and for study of the molecular biology of Asiatic black bears.

2017-03-20

修回日期：2017-04-24

发表日期：2017-11-10

Q959.838

A

2310-1490(2017)04-569-06

袁昕慧，女，24岁，硕士研究生；主要从事寄生虫分子生物学研究。E-mail：853786640@qq.com

*通讯作者：王妍，E-mail：2676806621@qq.com