β-氨基丁酸诱导烟草抗碱初步研究

尤本武，董建江，刘紫薇，杨波，郭家明，陈学平

1 中国科学技术大学烟草与健康研究中心，安徽省合肥市徽州大道1129号 230051；2 安徽省烟草公司，合肥市政务区潜山南路666号 230071；3 安徽中烟工业有限责任公司，安徽合肥市高新区天达路9号 230088

生物技术

β-氨基丁酸诱导烟草抗碱初步研究

尤本武1，董建江2，刘紫薇1，杨波3，郭家明1，陈学平1

1 中国科学技术大学烟草与健康研究中心，安徽省合肥市徽州大道1129号 230051；2 安徽省烟草公司，合肥市政务区潜山南路666号 230071；3 安徽中烟工业有限责任公司，安徽合肥市高新区天达路9号 230088

为探究外源BABA对提高烟草抵抗碱胁迫能力的机理。以云烟87为材料，从抗氧化系统，离子平衡和基因表达等方面来研究不同浓度BABA 对碱胁迫下烟草幼苗的调节作用。结果表明：外源施加0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA能促进碱胁迫下烟草幼苗根长和鲜重的增加；提高GSH、ASA、叶绿素和类胡萝卜素含量，降低脯氨酸和H2O2含量；增强超氧化物歧化酶、抗坏血酸还原酶、过氧化物酶和过氧化氢酶活性；降低烟草丙二醛含量和相对电导率来减轻碱胁迫对细胞膜损伤，提高有机酸含量缓解高pH毒害；降低Na+吸收，提高K+吸收来降低离子毒害。相对定量PCR表明：BABA可以诱导NtCaM和ABC转运蛋白家族基因表达来调节信号传导和物质转运；诱导GSH1和PROX1表达上调，促进GSH合成和脯氨酸代谢。以上结果表明：BABA诱导烟草抗碱是从抗氧化系统、有机酸合成、离子转运和基因表达等多方面综合作用的结果。

β-氨基丁酸；烟草；碱胁迫

盐碱地是指土壤所含盐分影响到作物正常生长，覆盖世界上约10%的土地。我国大部分盐碱地形成与土壤中碳酸盐积累有关[1]，因而碱化程度较高。在这种碱化土地上，植物不仅会受到碳酸盐积累所带来盐胁迫，还会受到高pH胁迫[2]。

在以往报道中，关于盐碱地研究主要是以NaCl为研究对象的中性盐胁迫为主[3]，而关于碱胁迫涉及较少。我国盐渍化土地大多伴随着土壤碱化，它们改变了土壤理化性质，提高了土壤pH，从而严重破坏了土壤生产力。在盐碱胁迫方面，Shi等研究认为有必要将盐碱胁迫区分为：由中性盐 NaCl为主引起的盐胁迫和以碱性盐 Na2CO3为主引起的碱胁迫[4]。与NaCl 相比，Na2CO3胁迫不仅引起离子胁迫，还引起高 pH 胁迫以及高pH造成的植物可利用矿物元素明显降低等胁迫；Yang等曾报道低浓度盐可以促进虎尾草生物量增加，而相同的碱胁迫则会大大降低其生物量[5]。因此，碱胁迫危害要远大于盐胁迫，对植物进行耐碱研究是一个非常必要的课题。

BABA（β-氨基丁酸）是一种外源非蛋白质氨基酸，研究报道过BABA能诱导烟草抗盐[6]、抗铜[7]、抗干旱[8]、高锌[9]、低钾[10]胁迫，而有关BABA诱导烟草抗碱却尚未见报道。本实验以“云烟87”为材料，研究不同浓度BABA对碱胁迫下烟草幼苗的调节作用，通过测定烟草中抗氧化酶活性、抗氧化物质含量、对不同矿物元素的吸收和转运以及相关基因表达方面来探究外源BABA对提高烟草抵抗碱胁迫能力的机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

烟草品种“云烟 87”由安徽农业科学院提供，BABA（纯度为 94%）市购， RNA 提取试剂盒和荧光定量PCR试剂盒购于北京天根生物技术有限公司，Taq 聚合酶和反转录试剂盒均购于大连TaKaRa 公司，引物由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。

1.2 生长条件和处理

将烟草种子均匀撒在由霍格兰营养液润湿的珍珠岩里，选取生长一致的3真叶龄幼苗分别移入加入同体积霍格兰营养液的育苗盒中。分4组，每组3盆，每盆12株，温度（28± 2）℃。16h 光照/d 预处理 3d 后，将碱胁迫组和BABA 组烟草幼苗移入含有 10mmol/ L Na2CO3的1/2霍格兰营养液中，对照组更换营养液，具体操作如表1所示。进入Na2CO3胁迫期5d后观察表型，拍照和提取茎叶部分总 RNA，测生理指标，实验设置3次重复。

表1 水培条件Tab.1 Hydroponics culture

1.3 生理指标测定

1.3.1 生物量和相对含水量的测定

完整取出植株, 用去离子水快速冲洗，量取根长；用滤纸吸干叶片表面水分，称取鲜重。相对含水量测定参考李玲等方法[11]。

1.3.2 Na+、K+、Ca2+、Mg2+ 含量的测定

用双蒸水冲洗植株3遍，滤纸吸干后置于105 ℃烘箱杀青15 min，75℃烘干至恒重。根和叶分别研磨成粉，采用Optima 7300DV等离子体原子发射光谱仪测定各元素含量。

1.3.3 相对电导率和丙二醛（MDA）含量的测定

相对电导率测定参照张清莉等方法[6]，MDA测定参照Stewart等的方法[12]。

1.3.4 有机酸含量的测定

有机酸含量的测定按李玲等方法[8]，结果换算成柠檬酸含量。

1.3.5 可溶性糖和可溶性蛋白含量的测定

可溶性糖含量测定使用蒽酮法，可溶性蛋白含量测定使用考马斯亮蓝法。

1.3.6 GSH、ASA、H2O2、脯氨酸和光和色素含量的测定

GSH、H2O2测定参照南京建成生物工程研究所GSH、H2O2测试盒说明书；ASA和光和色素测定参照李玲等的方法[8]，脯氨酸测定采用Michael等的方法[13]。

1.3.7 抗氧化酶活性的测定

APX和SOD活力测定参照张清莉等的方法[6]；POD活力测定参照李玲等的方法[8]；CAT活力测定依据南京建成生物试剂公司CAT测试试剂盒说明书。

1.4 数据分析

实验数据表示为平均值±标准偏差，数据分析采用单因素方差分析，置信区间 P<0.05，统计分析软件使用origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 BABA可以促进烟草幼苗在碱胁迫下生长

如图1所示，与对照组相比，在10mmol/L Na2CO3胁迫下，烟草生长受到明显抑制（图1B），主要为叶片发黄（图1B），植株鲜重降低（图1C），根长变短(图1A,D)。而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理下，相比于胁迫组，鲜重分别增加了107.11%和101.07%（图1C）；根长分别增加了40.00%和38.29%（图1D）；烟草幼苗含水量比碱胁迫组分别提高了4.97%和6.09%（图1E）。

2.2 BABA可以促进氧化胁迫保护酶的合成

CAT是植物清除H2O2的主要酶类，如图2A所示，在碱胁迫下烟草幼苗CAT活力比对照组提高了21.32%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，其活力比对照组分别提高了45.07%和106.18%。SOD可以将O2-快速歧化为H2O2和分子氧，碱胁迫后，烟草幼苗SOD活力下降了26.22%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，其活力较碱胁迫组分别提高了23.49%和32.62%（图2B）。POD可以催化H2O2参与的各种氧化反应，如图2C所示，在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，其活力分别提高了40.48%和48.57%。APX可以催化H2O2还原为H2O，是清除H2O2的主要酶类，在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，烟草幼苗APX活力分别提高了45.65%%和38.29%（图2D）。

图1 Na2CO3胁迫下BABA对烟草幼苗长势(A,B),鲜重(C),根长(D)和相对含水量(E)的影响Fig. 1 Effect of BABA on the growth (A,B), fresh weight (C), root length (D) and relative water content(E) of tobacco seedlings under alkaline stress

2.3 BABA可以促进烟草幼苗抗氧化物质的积累

抗坏血酸是植物体内抗氧化系统重要组成部分。从图3A可知，碱胁迫后烟草幼苗抗坏血酸总量比对照组提高了4.89%，还原型抗坏血酸含量下降了10.74%，脱氢抗坏血酸含量提高了14.55%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，其抗坏血酸总量分别提高了9.78%和15.56%，还原型抗坏血酸含量分别降低了40.28%和31.52%，脱氢抗坏血酸含量分别提高了41.26%和45.13%。图3B表明，碱胁迫后烟草幼苗的叶绿素a和叶绿素b含量分别下降了54.43%和51.52%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L的BABA处理后，与碱胁迫组相比，其叶绿素a含量分别提高了65.28%和91.67%，叶绿素b含量分别提高了72.2%和109.66%；类胡萝卜素在碱胁迫下含量下降了47.52%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，其含量较碱胁迫组分别提高了50.01%和75.02%（图3B）。GSH是叶绿体中重要的抗氧化物质，碱胁迫后，烟草幼苗GSH含量提高了16.46%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，其含量分别提高了34.12%和88.49%（图3C）。

2.4 BABA可以缓解烟草幼苗氧化胁迫损伤

MDA含量直接表明植物受到脂质过氧化作用损伤的程度。图4A表明，碱胁迫后，烟草幼苗MDA含量升高了93.30%，在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，其含量较碱胁迫组分别下降了32.92%和33.66%；植物受到逆境胁迫会产生大量活性氧，H2O2是活性氧的存在形式之一。图4B表明，在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后，烟草幼苗H2O2含量与胁迫组相比分别下降了61.23%和68.50%。相对电导率大小体现细胞膜受损害程度，而在0.2mmol/L和0.5mmol/LBABA处理后烟草幼苗相对电导率相比于碱处理组分别下降了8.79%和19.22%。

2.5 BABA可以促进有机酸的合成

图2 对照组、碱处理组、BABA组的烟草幼苗的CAT(A),SOD（B）,POD(C)和APX(D)活力变化Fig. 2 Activity of CAT (A), SOD ((B), POD(C) and APX(D) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

图3 对照组、碱处理组、BABA组的烟草幼苗的抗坏血酸(A),光合色素（B）,GSH(C)含量Fig. 3 ASA content (A), photosynthetic pigment content (B) and GSH content (C) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

有机酸是植物体生理代谢的一种具有缓冲作用的羧酸化合物，本研究中，碱胁迫下烟草幼苗根部有机酸含量下降，地上部分有机酸含量上升，且地上部分有机酸含量远大于根部。如图5所示，碱胁迫后，烟草幼苗有机酸含量与对照组相比，茎叶部含量升高了12.64%，根部有机酸含量下降了21.6%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，烟草幼苗地上部分有机酸含量较碱胁迫组上升了11.86%和8.76%（图5A），在0.5mmol/L BABA处理后，根部有机酸含量升高了13.27%（图5B）。

图4 对照组、碱胁迫组、BABA组的MDA含量(A),H2O2含量(B)和相对电导率差异(C)Fig. 4 MDA content (A),H2O2 conten(B) and relative electrical conductivity (C) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

图5 对照组、碱处理组、BABA组的烟草幼苗的茎叶部有机酸含量（A）和根部有机酸含量（B）Fig. 5 Organic acid content of shoot (A) and organic acid content of root (B) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

2.6 BABA可以促进渗透调节物质的积累

植物受到逆境胁迫时，会产生像脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等渗透调节物质。从图6中得到，碱胁迫处理后，烟草幼苗的脯氨酸含量升高了71.68%，可溶性糖含量降低了63.24%，可溶性蛋白含量也降低了14.75%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，其含量较碱胁迫组分别下降了44.98%和46.34%(图6A)；可溶性糖含量大幅增加（图6B）,分别提高了163.52%和194.03%；可溶性蛋白含量也分别增加了18.61%和19.47%（图6C）。

2.7 BABA可以促进碱胁迫下烟草幼苗的离子平衡

钠盐胁迫下，植物会降低对K+的吸收，产生高浓度Na+毒害作用。如图7所示，正常生长下，幼苗根部Na+含量高于地上部分，而在碱胁迫下，Na+从根部大量转移到地上部分，地上部分的Na+高出根部76.6%，同时根部和地上部分Na+含量相比于对照组分别提高了4.59倍11.62倍，K+含量分别降低了23.95%和28.19%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，相比于碱胁迫组，其根部Na+含量分别降低了2.57%和8.20%，地上部分的Na+含量分别降低了8.26%和20.97%（图7A）；烟草幼苗根部相比于胁迫组K+含量分别提高了9.51%和2.83%，并且在0.5mmol/L的BABA处理下，烟草地上部分K+含量提高了5.49%（图7B）；BABA处理后K+/ Na+比明显提高（图7E）。

图6 对照组、碱处理组、BABA组烟草幼苗的脯氨酸含量(A),可溶性糖含量(B)和可溶性蛋白含量(C)Fig. 6 Prolinecontent (A), soluble sugar content(B) and soluble protein content content(C) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

图7 对照组、碱处理组、BABA组的烟草幼苗Na+(A)、K+(B)、Ca2+(C)、Mg2+(D)含量和K+/Na+(E)Fig. 7 Na+ content(A), K+ content(B), Ca2+ content(C) , Mg2+ content(D) and K+/Na+(E) in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

图8 对照组、碱处理组、BABA组烟草幼苗NtCaM(A)、ABC(B)和PROX和GSH1(C)基因相对表达量Fig. 8 Expression of NtCaM(A),ABC(B),PROX andGSH1(C) genes in tobacco seedlings of the control, alkaline stress and BABA groups

碱胁迫后，烟草幼苗根部和地上部分Ca2+含量与对照组相比分别提高了35.18%和18.53%，而在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，其根部Ca2+含量分别提高了55.14%和67.66%，地上部分分别提高了27.00%和36.41%（图7C）。碱胁迫下，烟草幼苗根部Mg2+含量大量积累，而地上部分Mg2+却出现降低。在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，较碱胁迫组相比，根部Mg2+含量分别降低了7.22%和2.87%，地上部分Mg2+含量分别提高了3.15%和26.75%（图7D）。

2.8 BABA对碱胁迫下烟草幼苗相关基因表达的影响

钙调蛋白(CaM)在参与Ca2+调节过程中起重要作用，本文主要研究了4种NtCaM家族基因表达情况，如图8A所示，碱胁迫下，烟草幼苗NtCaM基因只有NtCaM1表达上调，其余均下调，而在0.2mmol/L BABA处理下，除NtCaM9和NtCaM13有所下调外，NtCaM1和NtCaM3表达均上调。在0.5mmol/LBABA处理下除NtCaM9外，NtCaM1、NtCaM3和NtCaM13均表达上调。ABC是一类庞大跨膜转运蛋白家族，我们主要研究了NtWBC1、NtPDR5a和NtPDR5b三种ABC转运蛋白基因的相对表达量，如图8B所示，外源施加0.2mmol/L和0.5mmol/L的BABA处理后，三种基因上调更加显著。GSH可以通过抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环清除叶绿体内的活性氧，如图8C所示，在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，烟草幼苗GSH1基因表达上调。脯氨酸含量则是植物受胁迫程度的指标，如图8C所示，在碱胁迫下，在0.2mmol/L和0.5mmol/L BABA处理后，脯氨酸脱氢酶基因PROX1表达显著上调，PROX2基因表达下调。

3 讨论

植物受到胁迫时会产生SOD、POD、CAT和APX等抗氧化酶和抗氧化分子清除多余的ROS以保护自己免受氧化伤害[14]。BABA处理可以提高碱胁迫下烟草幼苗SOD、POD、CAT和APX酶的活性，降低烟草幼苗的氧化损伤，这与张清莉等的实验结果是相同的[6]。同时BABA还可以促进AsA和类胡萝卜素的合成，诱导GSH1表达上调，促进GSH合成，而Chen等报道过GSH可提高盐胁迫下叶片抗氧化酶活性和抗氧化物质含量[15]；在叶绿体和细胞质中，ASA通过APX催化将H2O2还原成H2O，从而消除活性氧胁迫，保护叶绿体进行光合作用[16]；而类胡萝卜素具有抗光敏化作用、清除自由基等重要功能[17]。

植物受到盐碱胁迫时会伴随着渗透胁迫[4]，可溶性糖和可溶性蛋白是一类渗透调节物质，王川等认为可溶性糖含量的多少直接反应植物抗旱能力的强弱[18]，Singh等得到烟草细胞受到渗透胁迫时可产生新的可溶性蛋白参与渗透调节[19]。BABA可以促进可溶性糖和可溶性蛋白的产生来提高烟草幼苗的抗渗透胁迫能力。Lutts等认为，脯氨酸积累的多少是一个受胁迫伤害的指标[20]，宗会等也得到逆境胁迫下抗逆性较强的比抗逆性较弱的水稻品种脯氨酸积累少[21]，结果表明BABA处理后脯氨酸含量降低，因为BABA可以诱导产生更多的可溶性糖和可溶性蛋白参与渗透调节，降低对脯氨酸调节的需求。此外BABA还可以诱导脯氨酸脱氢酶基因PROX1表达显著上调，加速降解脯氨酸，而脯氨酸降解又可以产生大量能量，快速补充烟草对碳、氮和能量的需求[22]。

植物维持较低浓度Na+和较高浓度K+是许多酶促反应的基础条件，碱胁迫下，Na+可以通过竞争K+通道被植物吸收[23]，降低植物对K+的吸收。植物根部受到碱胁迫时会导致细胞膜丧失离子选择的能力从而导致Mg2+累积[24]。BABA可以诱导ABC转运蛋白基因的表达上调，促进金属离子和次生代谢物转运[25-26]，从而促进Ca2+和Mg2+的吸收和转运。而Ca2+的吸收不仅可以维持细胞的稳定性，还可以通过SOS途径促进Na+外排[27]，增强其对碱胁迫的适应能力。此外BABA还可以通过诱导NtCaM家族中部分基因（主要是NtCaM1和NtCaM3）表达上调来促进Ca2+信号传导，从而增强烟草碱抗能力。而Mg2+的吸收可以促进叶绿素的合成，从而促进烟草生长。同时，BABA还可以促进有机酸的合成，有机酸在渗透调节、离子平衡及pH稳定中起着重要作用[28-29]。实验中，地上部分的有机酸含量远大于根部，这与Chen等关于沙棘的研究结果相同[30]。结果表明，外源BABA通过调节烟草幼苗有机酸合成来稳定pH，调节渗透压来降低碱胁迫的危害。关于各种有机酸的具体作用机理还有待进一步研究。

4 结论

碱胁迫下烟草生长受到明显抑制，叶片发黄，根长变短，生物量下降，膜脂质过氧化作用加剧，导致细胞膜受到损害，细胞膜通透性增加，电解质外泄，产生渗透胁迫等；而高pH则导致金属元素沉淀，不易转运利用，并且加剧损害烟草细胞膜系统，形成活性氧胁迫。外源施加BABA后，上述症状得到明显缓解，促进了烟草幼苗的生长，烟草的生物量增加，含水量提高，光和色素含量增加。本研究结果表明，外源施用BABA可以抵御碱胁迫的部分危害，是一个高效抗逆性调节物质。

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：YOU Benwu, DONG Jianjiang , LIU Ziwei, et al. Preliminary study on BABA-induced resistance to alkaline stress in tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2017, 23(1)

*Corresponding author. Email：chenxp08@ ustc. edu. cn

Preliminary study on BABA-induced resistance to alkaline stress in tobacco

YOU Benwu1, DONG Jianjiang2, LIU Ziwei1, YANG Bo3, GUO Jiaming1,CHEN Xueping1*
1 Tobacco and Health Research Center, University of Science and Technology of China, Hefei 230051, China;2 Anhui Provincial Tobacco Company, Hefei 230071, China;3 China Tobacco Anhui Industrial Co. Ltd., Hefei 230088, China

This study introduced the function of BABA in regulating tobacco on alkaline stress and attempted to explore the mechanism through antioxidant system, iontransport and related genes expression. Results showed that both 0.2mmol/L and 0.5mmol/L BABA could significantly increase root length and fresh weight of tobacco under alkaline stress. BABA could increase contents of GSH, ASA, chlorophyll, carotenoid and activities of SOD, APX, POD and CAT while decrease contents of H2O2, proline, MDA and relatively conductivity rate. Decreasing Na+content and increasing K+content were to defense ion toxicity and increasing organic acid content could defend high pH toxicity under BABA treatment. Result of real-time relative quantitative PCR showed that BABA could induce NtCaM and ABC translocator genes up-regulated expression to regulate transport and signal transduction and it also induced GSH1and PROX1 genes up-regulated expression to promote the GSH synthesis and proline metabolism. The above evidences suggested that BABA-induced resistance to alkaline stress in tobacco resulted from integrated effect of antioxidant, organic acid synthesis, ion transport and gene expression.

β-aminobutyric acid; tobacco; alkaline stress

尤本武,董建江,刘紫薇，等. β-氨基丁酸诱导烟草抗碱初步研究[J]. 中国烟草学报，2017,23（1）

江西省烟草公司“提高烟草抗逆性的新型调节物质研制及应用”（赣2011.01.001号）和“基于氯化血红素的高效生长调节剂的研制”（皖0920140421003号）

尤本武（1992—），硕士，主要研究方向：植物抗逆性研究， Email：sa520250@ mail. ustc. edu. cn

陈学平（1956—），博士，教授，主要研究方向：植物生物技术及遗传改良， Email: chenxp08@ ustc. edu. cn

2016-08-22；< class="emphasis_bold">网络出版日期：

日期：2017-01-25