HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响*

宋彬妤 ，赵嘉伟 ，宋静 ，陈思思 ，胡志廷 ，韩昕 ，王敏敏 ，任来峰

（1.山西医科大学汾阳学院 科技中心，山西 汾阳 032200；2.厦门大学医学院 临床医学系，福建 厦门 361002；3.山西医科大学汾阳学院 医学检验系，山西 汾阳 032200）

HCV NS4B表达载体的构建及其对细胞凋亡的影响*

宋彬妤1，赵嘉伟2，宋静3，陈思思3，胡志廷3，韩昕3，王敏敏1，任来峰3

（1.山西医科大学汾阳学院 科技中心，山西 汾阳 032200；2.厦门大学医学院 临床医学系，福建 厦门 361002；3.山西医科大学汾阳学院 医学检验系，山西 汾阳 032200）

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）2a型非结构蛋白4B（NS4B）的真核表达载体，并观察其对骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响。方法 以质粒PJFH1为模板，通过PCR反应扩增NS4B目的基因片段，采用同源重组法与PCMV-tag2b载体相连，转化大肠杆菌感受态DH5α，筛选正确的克隆。以脂质体为介导转染U2OS细胞，通过Western blot检测NS4B蛋白的表达，免疫荧光检测细胞的凋亡。结果 构建pCMV-tag2b-NS4B重组质粒，经测序其与NCBI公布的序列完全一致，并可在U2OS细胞中表达，DAPI检测显示细胞凋亡率为（17.25±2.95）%，对照组凋亡率为（6.53±2.36）%。结论 成功构建NS4B的真核表达载体，并可在U2OS细胞中表达，诱导细胞凋亡。

丙型肝炎病毒；非结构蛋白4B；重组质粒；凋亡

丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是造成慢性肝炎、肝纤维化及肝细胞肝癌的重要病因之一，严重威胁人类的生命健康[1]。研究表明，HCV非结构蛋白 4B（nonstructural protein 4B，NS4B）参与病毒复制、组装及释放等过程[2-3]。最近研究表明，NS4B可能参与宿主细胞的多种信号转导通路，干扰转录调控、内质网应激、恶性转化等过程，但各研究结果存在分歧[4-6]。因此，本研究构建HCV NS4B表达载体，并观察其对人骨肉瘤细胞U2OS凋亡的影响，为后续进一步研究其致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

U2OS细胞株保存在液氮中，质粒pCMV-Tag 2b和pJFH1（HCV 2a型cDNA）置入-20℃冰箱冷冻保存，大肠埃希菌DH5α购自北京康为世纪生物科技有限公司，In-Fusion HD Cloning Kit购自美国Clontech公司，限制性内切酶HindⅢ购自美国NEB公司，质粒抽提试剂盒、凝胶回收试剂盒均购自美国Promega公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，DMEM（高糖）培养基、ECL化学发光试剂购自武汉博士德生物工程有限公司，DNA转染试剂Lipofectamine 2000及核染料DAPI购自美国Invitrogen公司，抗Flag抗体和二抗（HRP标记）购自美国Sigma公司，引物合成和DNA测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，DM 4000型荧光显微镜购自德国Leica公司，Eon型酶标仪购自美国BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 NS4B引物的设计与合成 根据质粒pJFH1序列和质粒pCMV-Tag 2bHindⅢ酶切位点两端的序列，利用同源重组的原理设计NS4B引物，正向引物 P1：5'-ATTCGATATCAAGCTTGCCTCTAGGGCGG CTCTC-3'，正向引物 P2：5'-CGGTATCGATAAGCTT TCAGCATGGGATGGGGCAGT-3'。

1.2.2 NS4B扩增及鉴定 以质粒pJFH1为模板，以P1、P2为引物，通过PCR反应扩增目的基因NS4B，反应条件：95℃预变性 2 min，95℃变性 25 s，55℃退火30 s，72℃延伸100 s，共30个循环，72℃继续延伸6 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳，根据分子量大小初步鉴定。

1.2.3 pCMV-tag2b-NS4B重组质粒的构建及鉴定HindⅢ酶切pCMV-tag2b载体与目的基因PCR产物由In-Fusion重组酶进行连接，重组反应体系：目的片段 3 μl，pCMV-tag2b 1 μl，In-fusion 重组酶混合物 2 μl，ddH2O 4 μl，总体系为 10 μl，55℃反应30 min。反应产物转化感受态DH5α大肠杆菌，在LB固体培养基上挑取数个单克隆菌落，筛选重组质粒提取其质粒，进行双酶切鉴定，鉴定正确的质粒送至上海生工生物工程股份有限公司进一步测序鉴定。

1.2.4 细胞的复苏、培养及转染 将液氮中的U2OS细胞株取出，放入37℃水浴箱中快速搅动融化，置于3倍体积DMEM（高糖，含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）培养基的无菌离心管中，1 500 r/min离心3 min，弃上清液，并加入含有DMEM培养基的细胞瓶中，于5%二氧化碳CO2、37℃孵箱中连续培养。当细胞汇合度达85%左右时，用0.25%胰酶消化传代。转染前，将U2OS细胞培养于细胞培养板/孔中，待汇合度达50%～60%时，按Lipofectamine 2000试剂盒说明书进行脂质体转染。设置PCMV-tag2b空载体组和PCMV-tag2b-NS4B载体组，在转染后48～72 h，进行后续实验。

1.2.5 细胞凋亡检测 U2OS细胞接种到细胞爬片上，按上述方法转染相应质粒。转染48 h后收样，室温下用PBS漂洗5～10 min/次，共3次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次；再经0.3%TritonX-100通透处理10 min，PBS漂洗；DAPI染核，封片，荧光显微镜下观察、拍照。凋亡细胞计数参照文献[7]的方法进行。

1.2.6 Western blot检测 细胞转染pCMV-tag2b-NS4B 48 h后，用RIPA细胞裂解液裂解转染细胞（设未转染组为对照），抽提总蛋白，经Bradford法定量，加入5×上样缓冲液煮沸备用；经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，湿转法（200 mA，2 h）将蛋白转印至PVDF膜上，根据蛋白分子量条带剪下所需的膜，室温下5%脱脂奶粉封闭2 h；抗Flag（1∶500比例稀释）或α-tublin（1∶5 000比例稀释）单克隆抗体4℃过夜，TBST漂洗5 min/次，共3次；再用HRP标记的抗鼠二抗（1∶2 000比例稀释）孵育1.0～1.5 h，TBST漂洗5 min/次，共3次；混合ECL发光试剂显色，用Fluor Chem FC2成像仪采集图像。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 构建pCMV-tag2b-NS4B载体

本研究所用载体为pCMV-tag2b。构建策略为选用HindⅢ为内切酶，设计目的基因PCR引物时，在正、反向引物的5'-端分别添加16个与载体酶切位点上游同源的碱基序列，应用同源重组的原理将酶切的载体与PCR产物连接起来（见图1）。首先扩增HCV NS4B基因，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳可见约780bp的特异性条带（见图2）；然后进行重组质粒的克隆。挑取获得的细菌克隆扩增培养，提取质粒DNA，HindⅢ酶切，再经1%琼脂糖凝胶电泳分析（见图2）。酶切产物与PCR产物均在约750 bp处出现一条带，与NS4B的片段长度接近，初步提示重组质粒克隆成功。

图1 pCMV-Tag2b载体结构

图2 pCMV-tag2b-NS4B重组质粒鉴定

2.2 pCMV-tag2b-NS4B质粒测序

将上述构建的重组质粒送上海生工生物工程股份有限公司测序，测序引物为CMV正向引物：CGCA AATGGGCGGTAGGCGTG（见图3）。将结果序列与pJFH1 NS4Bb的标准序列进行比对，显示匹配度为100%，表明成功构建NS4B真核表达质粒pCMV-tag 2b-NS4B。

2.3 NS4B蛋白在U2OS细胞中的表达

将U2OS细胞复苏并在细胞瓶中培养（见图4）。细胞转染pCMV-tag2b-NS4B或pCMV-tag2b（同时设不转染组对照）48 h后，收集细胞，经Western blot检测U2OS细胞中NS4B蛋白的表达，结果显示，只有在转染PCMV-tag2b-NS4B载体的细胞（实验组）中才表达NS4B蛋白（见图5）。

2.4 NS4B蛋白诱导U2OS细胞凋亡

细胞转染相应质粒48 h后，收集细胞，经DAPI染细胞核后在荧光显微镜下观察，分别计数其凋亡情况。转染pCMV-tag2b-NS4B组凋亡率为（17.25±2.95）%，转染PCMV-tag2b组凋亡率为（6.53±2.36）%，经 t检验，差异有统计学意义（t=4.919，P=0.008）。见图6。

图3 pCMV-tag2b-NS4B重组质粒测序图谱

图4 U2OS细胞形态 （×20）

图5 NS4B在U2OS细胞中的表达

图6 HCV NS4B对细胞凋亡的影响 （×100）

3 讨论

分子克隆是现代生命科学研究中最基本的技术方法之一，传统的分子克隆通过双酶切法把目的基因连接到载体上。该方法首先应用2种限制性内切酶分别切割目的基因和载体，产生带有相同末端序列的目的基因片段和线性载体，然后用T4 DNA连接酶连接形成重组载体。最新发展起来的一种利用同源重组的原理进行分子克隆的方法，应用本方法设计引物时须在目的基因的2条引物5'-端添加15～20个与载体酶切位点上游同源的核苷酸序列，最后加入重组酶，可将酶切后的载体和目的基因连接到一起，产生重组质粒[8]。同源重组法跟双酶切法相比，具有更加简单、快速、克隆效率高等优点[9-10]。本研究是利用同源重组的方法克隆HCV NS4B的重组载体pCMV-tag2b-NS4B，经酶切和测序证明获得的重组质粒正确无误。Western blot检测证明，本实验构建的重组载体可以在U2OS细胞中正确表达目的基因产物NS4B蛋白。

本研究将PCMV-tag2b-NS4B载体转染U2OS细胞，24 h后通过DAPI染细胞核，在荧光显微镜下观察到明显的细胞凋亡。这与ZHAO等[5]在293T细胞和Huh7细胞中的研究结果一致。RUTKOWSKI[11]和张艳妮等[12]发现，NS4B可通过诱导细胞的非折叠蛋白质反应而启动细胞凋亡。李昌平等[13]在人正常LO2肝细胞中转染表达NS4B后，胰岛素样生长因子IGF-Ⅱ表达上调，而抑癌基因P16表达下调，具有促进肝细胞增殖；此外，NS4B可能抑制Caspase-3表达、促进Survivin的表达而抑制肝细胞凋亡[13-14]；最近研究表明，NS4B可活化EOR-Ca2+-ROS-NF-κB，抑制HCV感染诱导的肝细胞凋亡[15]。各实验室得出矛盾的结果其原因可能是所用的载体、细胞系等实验条件不同所致，具体细节尚待进一步研究。

综上所述，本实验利用同源重组法成功构建HCV NS4B的真核表达载体，初步研究发现NS4B可诱导U2OS细胞凋亡，为后续进一步深入研究HCV NS4B的生物学功能奠定基础。

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Construction of expression vector of HCV NS4B and its effect on cell apoptosis*

Bin-yu Song1,Jia-wei Zhao2,Jing Song3,Si-si Chen3,Zhi-ting Hu3,Xin Han3,Min-min Wang1,Lai-feng Ren3
(1.Science and Technology Center,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,Shanxi 032200,China;2.Department of Clinical Medicine,School of Medicine,Xiamen University,Xiamen,Fujian 361002,China;3.Department of Laboratory Medicine,Fenyang College,Shanxi Medical University,Fenyang,,Shanxi 032200,China)

Objective To constructan eukaryotic expression vector ofHepatitis C virus (HCV)nonstructural protein NS4B,and investigate the effect of this protein on apoptosis of U2OS cells.Methods The fragment of target gene NS4B was obtained by PCR,and connected with the PCMV-tag2b vector using the homologous recombination method,and the PCMV-tag2b-NS4B was transformed into theE.coliDH5a.The right recombinant plasmid was selected.Lipofectamine 2000 was used to transfect PCMV-tag2b-NS4B into U2OS cells.Western blot was applied to detect the expression of HCV NS4B protein in U2OS cells,and immunofluorescence(IF)was used to assess the apoptosis of U2OS cells.Results The data showed that the recombinant plasmid PCMV-tag2b-NS4B was consistent with the one published on NCBI and could express HCV NS4B protein in U2OS cells.DAPI staining showed that the apoptosis rate of the PCMV-tag2b-NS4B group was(17.25±2.95)%and that of the control group was(6.53±2.36)%.Conclusions The eukaryotic expression vector of HCV NS4B has been successfully constructed,and HCV NS4B protein is expressed in U2OS cells and induces apoptosis.

Hepatitis C virus;nonstructural protein 4B;recombinant plasmid;apoptosis

R373.21

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.005

1005-8982（2017）26-0025-05

2016-12-26

山西省自然科学基金（No：2014021037-9）；山西省高等学校大学生创新创业训练项目（No：2014052）；山西医科大学汾阳学院科技发展基金（No：2016B02）

任来峰，E-mail：rlaifeng@163.com，Tel:15333434863

（童颖丹 编辑）