银杏叶提取物对COPD大鼠肺组织超微结构的影响*
2017-11-16潘玲邓祯谭玉萍杨红梅杨益宝梁炜李瑞祥
潘玲，邓祯，谭玉萍，杨红梅，杨益宝，梁炜，李瑞祥
（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）
基础研究·论著
银杏叶提取物对COPD大鼠肺组织超微结构的影响*
潘玲，邓祯，谭玉萍，杨红梅，杨益宝，梁炜，李瑞祥
（广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011）
目的 研究银杏叶提取物（GBE）对慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺组织超微结构的影响。方法将清洁级7周龄雄性Wistar大鼠90只称重，随机分组为正常对照组（A组）、COPD对照组（B组）、银杏叶提取物早期干预组（C组）、银杏叶提取物后期干预组（D组）、红霉素早期干预组（E组）、红霉素后期干预组（F），并复制模型。每组随机选取6只，利用透射电镜，观察各组大鼠肺组织超微结构改变，计算线粒体病变率。结果 B、C、D、E、F组有COPD特征性改变，但程度不同。电镜下观察各组较B组结构更完整，线粒体各种病变发生率降低（P＜0.05），提示各治疗组对COPD大鼠有积极治疗作用。结论 GBE能够延缓和改善COPD大鼠模型的形成。
慢性阻塞性肺疾病；银杏叶提取物；超微结构；线粒体病变率
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pul- monary disease，COPD）是一种累及气道、肺实质及肺血管的常见慢性疾病。其特征是慢性炎症的发展引起气道重塑，导致气流受限和肺组织破坏[1-2]。其高发病率与吸烟及空气污染密切相关。前期研究证实，银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，GBE）能抑制肺气肿的形成及肺血管重塑，早期干预效果更好[3-4]。本研究在前期研究的基础上，设红霉素早、晚期对照组，分别与GBE早、晚期干预组对比，在电镜下观察GBE和红霉素对COPD大鼠肺组织超微结构的影响，研究两者对COPD大鼠的疗效及其区别。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂、材料及仪器 脂多糖（美国Sigma公司），过滤嘴香烟（南宁卷烟厂真龙牌香烟，尼古丁1.2 mg/支，焦油19 mg/支）。自制有机玻璃密闭箱（规格：80 cm×60 cm×50 cm，上方有一通气孔，半径为0.6 cm），透射电镜（广西医科大学电镜室提供，机型：日立HITACH H-7650），舒血宁注射液主要成分为 GBE，规格：5 ml/支，GBE 17.5 mg/支，河北神威药业有限责任公司生产，注射用乳糖酸红霉素30万u/瓶（大连美罗大药厂生产）。
1.1.2 动物选择及分组 7周龄健康清洁级雄性Wistar大鼠（广西医科大学动物实验中心供给，动物编号：SCXK20090002）90只，称重后随取分为正常对照组（A组）、COPD对照组（B组）、GBE早期干预组（C组）、GBE后期干预组（D组）、红霉素早期干预组（E组）、红霉素后期干预组（F组）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的复制 A组无需复制模型，于第1和第14天向大鼠气管内注入0.9%氯化钠溶液（2 ml/kg）。B、C、D、E、F 组采取烟雾吸入、气管内注入脂多糖、冷空气刺激复制COPD模型。28 d后，随机处死B、C、D、E、F组大鼠各2只，以确认模型复制成功。
1.2.2 COPD动物模型评估 光镜下观察大鼠肺组织有以下COPD病理特征：各级支气管周围有炎症细胞浸润，气道重塑，部分肺泡融合，甚至形成肺大泡。电镜下可见支气管纤毛柱状上皮细胞胞浆肿大，呈大泡样突起，部分纤毛脱落，未脱落的变短；Ⅱ型肺泡上皮细胞明显变性，结构不清，核膜破坏，核染色质边聚，板层小体减少，线粒体肿胀、空泡化、嵴破坏甚至消失，内质网扩张。血管内皮细胞肿胀变形，见大量成纤维细胞，提示COPD模型复制成功。
1.2.3 药物干预 实验第1～14天，C组用GBE干预，E 组用红霉素干预；A、B、D、F 组用生理盐水对照。实验第29～42天，D组用GBE干预，F组用红霉素干预；A、B、C、E组用生理盐水对照。用药量：C、D组0.4 ml/（kg·d）（根据成人标准量0.29 ml/kg，采取体表面积比值法：大鼠用药量=成人量×70/56）；E、F组红霉素用药量根据体表面积换算为10 mg/kg2；A、B组用生理盐水（1ml/只，1次/d）对照。采用腹腔注射给药。
1.2.4 标本采集及制作 实验完成后（即第43天），6组大鼠用10%乌拉坦麻醉，随后每组随机选6只剖取右肺下支气管和肺组织1 mm×1 mm×1 mm，置于2.5%戊二醛固定液，1%锇酸固定，醋酸双氧铀块染，脱水，EUP 812包埋剂包埋。用钻石刀切500 A超薄片，200目铜网捞起，醋酸双氧铀滴染，柠檬酸铅复染，再进行投射电镜观察。
1.2.5 电镜检测 采用电子透射电镜观察，并且随机拍摄全貌、局部及细胞器图像，观测并对比各组Ⅱ型肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及成纤维细胞的超微结构变化。并计算线粒体和线粒体嵴的数量，计算每组每幅图像里有病变征象的线粒体和线粒体嵴所占百分比。
1.3 统计学方法
数据分析采用SAS 9.3统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用方差分析，方差齐则两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况
实验中因麻醉意外导致E组大鼠死亡1只。实验前后6组大鼠体重比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表1）。实验后B组与其余5组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），E组与 C、D 组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其他各组相互比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表1）。精神状况：A组良好，B组较差，C、E组一般，D、F组稍差；进食情况：A组良好，B组较差，C、E组一般，D、F组稍好。
2.2 肺组织外观
解剖各组大鼠，A组大鼠两肺形态正常，色淡粉，触之光滑，质地柔软，气管及支气管未见明显分泌物；余各组均发现大鼠两肺体积不同程度地增大，颜色较暗且略带苍白，触之粗糙，质地偏韧硬，气道黏膜红肿，有较多的黏性分泌物。其中以B组情况最为严重。
表1 各组大鼠实验前后体重比较 （n=13，g，±s）
表1 各组大鼠实验前后体重比较 （n=13，g，±s）
组别 实验前大鼠体重 实验后大鼠体重A组 270.503±14.423 294.426±24.448 B 组 234.889±17.003 264.811±23.333 C 组 239.064±15.519 315.813±33.701 D组 234.943±11.527 308.462±25.976 E 组 248.496±20.971 288.418±17.257 F组 239.814±15.504 292.687±23.351 F值 9.326 6.452 P值 0.000 0.000
2.3 电镜观察结果
2.3.1 肺泡上皮细胞改变 A组大鼠支气管上皮细胞纤毛排列整齐，基本无脱失、紊乱；肺组织Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞无异常，血管内皮细胞膜完整。其中，Ⅰ型肺泡上皮细胞胞浆内细胞器较少，Ⅱ型肺泡上皮细胞胞浆内富含板层小体及线粒体，板层小体结构正常，平行分布，线粒体嵴突完整，未见肿胀或变形。B组支气管上皮细胞纤毛脱落、紊乱；Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞结构严重异常，血管内皮细胞膜变性，微绒毛减少、断裂甚至脱落；肺泡内可见上皮细胞坏死、脱落，并部分腔内可见渗出物；Ⅰ型上皮细胞出现增生，Ⅱ型上皮细胞可见损害性变化，部分板层小体明显溶解，呈排空状，肺泡腔内可见较多表面活性物质。部分线粒体肿胀明显，嵴突断裂或消失，内皮外基膜多处不完整，部分并有内质网扩张和肺泡壁纤维组织弥漫性增生。肺气-血屏障有损伤，基底膜较A组变薄，部分有断裂，肺泡隔毛细血管腔内凝血。C组与E组类似，大鼠支气管纤毛排列较整齐，有少量脱失、紊乱；大鼠肺组织细胞微绒毛减少、断裂情况少见；肺泡上皮细胞中的巨噬上皮细胞有所增多，体积较大，细胞浆丰富；板层小体空泡化少；肺泡腔内脱落的如巨噬细胞等炎症细胞较少，渗出物较少。并可见成纤维细胞少量增生。D组与F组类似，大鼠支气管纤毛较紊乱，可见脱落及紊乱，情况较B组轻，肺组织细胞微绒毛减少、断裂情况较C组和E组稍严重；肺泡上皮细胞中的巨噬上皮细胞增多；板层小体空泡化较多；肺泡腔内脱落的如巨噬细胞等炎症细胞及渗出物较多。见图1。
图1 各组Ⅱ型肺泡上皮细胞 （电镜×20 000）
2.3.2 血管内皮细胞改变 A组大鼠血管内皮细胞膜未发生破裂，内质网无扩张。B组血管内皮细胞肿胀变形，甚至有细胞核染色质高度致密，呈核固缩表现。C组和E组血管内皮细胞肿大变形。D组和F组血管内皮细胞肿胀变形，程度较C组和E组加重。见图2。
2.3.3 成纤维细胞改变 A组大鼠电镜下可见成纤维细胞数量少，胞体较小。B组大鼠镜下可见成纤维细胞数量明显增多。C组和E组电镜下可见成纤维细胞有增多，但不明显。D组和F组可见成纤维细胞增多，程度较C组和E组稍严重。见图3。
2.3.4 各组大鼠肺组织线粒体病变率比较 B组较A组的线粒体肿胀肥大、空泡变及嵴突病变的病变率均增高，而C、D、E、F组的线粒体各种病变率较A组增高，而较B组降低。其中C、D、E、F组中，C、E组较D、F组的病变率低，C、D组较E、F组有所降低（P＜0.05）。可见药物干预能一定程度降低COPD大鼠肺组织的线粒体病变率，以GBE早期干预的效果最佳。见表2。
图2 各组血管内皮细胞 （电镜×30 000）
图3 各组成纤维细胞 （电镜×30 000）
表2 各组大鼠肺组织线粒体病变率比较 （n=13±s）
表2 各组大鼠肺组织线粒体病变率比较 （n=13±s）
组别 病变线粒体/个 肿胀肥大/%A组 21.133±1.192 20.745±1.481 B组 78.296±3.453 85.862±5.643 C组 42.508±3.967 41.809±3.064 D组 52.891±4.143 48.744±1.231 E组 44.554±4.156 43.417±2.949 F组 56.013±4.193 50.134±1.832 F值 156.318 282.929 P值 0.000 0.000空泡变/% 嵴突病变/%20.604±1.476 21.561±1.994 77.952±1.101 80.184±3.621 25.986±1.593 30.993±2.681 38.981±2.768 24.882±1.041 27.011±1.682 33.731±2.706 40.041±2.924 28.232±1.334 625.127 496.008 0.000 0.000
3 讨论
COPD发病的普遍性及危害性，给社会造成巨大危害，给患者造成巨大的经济负担。目前认为COPD发病的中心环节是气道炎症，在气道、肺实质及肺血管都存在肺泡巨噬细胞和中性粒细胞增加，激活的炎症细胞可释放TNF-α、IL-8、IFN-γ等多种炎症介质，以上多种炎症介质能使肺组织的结构产生毁损，并有促进粒细胞炎症反应的作用[5]。有文献表明，气道、肺血管的慢性炎症反应导致结构变化，在COPD发病机制中发挥重要的作用，产生该作用可能与氧化应激的线粒体功能障碍有关[6-7]。经常吸烟或处在污染空气中易引起内皮功能受损，内皮细胞功能异常被认为是血管增殖和血管结构异常的最主要因素之一[8]。有学者电镜下观察，暴露于烟草、烟雾及脂多糖可造成肺组织毛细血管内皮细胞线粒体减少、水肿，饮泡增多，与基底膜连接处增厚，肺小动脉内弹力膜菲薄、断裂，管壁大量胶原纤维增生，而预防性使用红霉素可干预上述的超微结构变化，电镜下可见内皮细胞无明显脱落，管壁平滑肌增殖，但胶原纤维增生明显减少[9-11]。邵有和[12]和欧莉梅等[13]研究证实，红霉素治疗COPD稳定期能降低痰白细胞总数和中性粒细胞比例，急性发作次数明显减少，说明红霉素对控制COPD急性发作是有积极意义的。张军等[14]的研究进一步说明，红霉素不但能预防COPD患者的急性发作，而且能降低COPD急性发作的严重程度。
积极探索应用中医中药治疗COPD对于控制发病次数、降低病死率、减轻社会负担有重要的意义。银杏叶治疗肺系疾病在我国有着十分悠久的历史，最早载于《神龙本草经》，有润肺、止咳、平喘的功效。GBE是银杏树干燥叶的提取物，成分主要为黄酮类、萜内酯类，以及少量的多酚类、生物碱、长链醇、酮类及微量元素等。近年来国内外研究表明，GBE具有抗氧化，清除自由基，拮抗PAF，抑制细胞凋亡，调节细胞间黏附分子-1表达及兴奋性氨基酸释放，改善微循环等多种作用[15]。
本实验参照刘鑫等[16]的烟雾吸入、气道内注入脂多糖联合冷空气刺激的方法复制COPD模型，分别用GBE和红霉素进行早、晚期干预。用足疗程后观察大鼠一般情况，电镜下观察气管和肺血管的变化情况。结果显示，造模未治疗组存在COPD急性加重的症状，经过治疗后各组症状有所减轻，其中C组和E组情况最好。解剖各组大鼠发现，造模组颜色较暗且带有苍白色，触之粗糙，质地偏韧硬，气道黏膜肿胀，可见有较多的黏性分泌物。治疗组情况较造模组改善。电镜下观察GBE干预组和红霉素干预组大鼠支气管纤毛排列较整齐，有少量脱失、紊乱；大鼠肺组织细胞微绒毛减少、断裂情况少见；肺泡上皮细胞中的巨噬上皮细胞增多，体积较大，细胞浆丰富；板层小体空泡化少；肺泡腔内脱落的如巨噬细胞等炎症细胞较少，渗出物较少；且GBE干预组和红霉素干预组大鼠肺组织线粒体的病变率较造模组减少。以上说明GBE能一定程度上减轻支气管和小动脉周围的炎症反应，从而抑制其结构重塑。这与红霉素的作用效果类似。有研究证实，红霉素不仅具有抗菌作用，在治疗COPD时其免疫调节作用可能比抗菌作用更为重要[17]。早期研究证实GBE能抑制肺泡融合等肺泡结构改变，还对减少腺泡内肺血管壁周围的炎症细胞、肺动脉血管平滑肌细胞增殖，抑制肺血管重塑有较好的效果。刘忠等[18-19]研究表明，GBE可降低AE-COPD血清中IL-8和TNF-α浓度，抑制COPD大鼠ET-1、TGF-β1水平，对AE-COPD气道炎症具有抑制作用。GBE对COPD模型大鼠的肺脏具有治疗作用，可能是其重要作用机制。楼黎明等[20]的研究结果表明，GBE可降低AE-COPD患者血清E-selectin和VCAM-1水平，改善肺功能，与本研究结果一致。
综上所述，GBE能在一定程度上延缓和改善大鼠肺组织及肺血管周围炎症，抑制支气管、肺血管结构重塑，延迟肺间质纤维化的进展，降低线粒体的病变率。其作用与红霉素类似，并有可能优于红霉素，进一步研究GBE的具体抗炎机制将是笔者接下来的研究方向。
[1]中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组.慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2013年修订版）[J].中华结核和呼吸杂志,2013,36(4):255-264.
[2]VESTBO J,HURD S S,AGUSTI A G,et al.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructivepulmonary disease:GOLD executive summary[J].Am J Respir Crit Care Med,2013,187(4):347-365.
[3]谭玉萍,王朝晖,蒙定水,等.银杏叶提取物可抑制慢性阻塞性肺疾病大鼠气道及肺血管重塑[J].中国呼吸与危重杂志,2008,7(4):274-276.
[4]谭玉萍,王朝晖,蒙定水,等.银杏叶提取物对肺气肿大鼠血管内皮生长因子的影响[J].广西医科大学学报,2010,27(2):208-210.
[5]郑大炜.氨溴索对慢性阻塞性肺疾病患者血清IFN-γ、IL-8及CRP的影响[J].中国现代医学杂志,2014,24(15):51-53.
[6]付东伟,崔吉宏,涂钰林.沙美特罗替卡松与氨茶碱联合治疗对慢性阻塞性肺疾病急性加重期疗效和氧化应激的影响[J].中国现代医学杂志,2017,27(2):119-122.
[7]WIEGMAN C H,MICHAELOUDES C,HAJI G,et al.Oxidative stress-induced mitochondrial dysfunction drives inflammation and airway smooth muscle remodeling in patients with chronic obstructive pulmonary disease[J].J Allergy Clin Immunol,2015,136(3):769-780.
[8]DOYLE M F,TRACY R P,PARIKH M A,et al.Endothelial progenitor cells in chronic obstructive pulmonary disease and emphysema[J].PLoS One,2017,12(3):DOI:10.137/journal.pone.e0173446.
[9]ZHANG M,XIE Y,YAN R,et al.Curcumin ameliorates alveolar epithelial injury in a rat model of chronic obstructive pulmonary disease[J].Life Science,2016,164:1-8.
[10]张建全,陈珣珣,梁毅,等.吸烟肺功能正常者及吸烟COPD患者肺小动脉超微结构的研究[J].中国呼吸与危重监护杂志,2010,9(5):465-470.
[11]周广,梁毅,钟小宁,等.红霉素对烟草烟雾暴露致肺气肿大鼠肺血管超微结构的影响[J].广西医科大学学报,2014,31(6):926-928.
[12]邵有和,陈昌枝,覃淑娟,等.小剂量红霉素对慢性阻塞性肺疾病稳定期患者免疫功能的干预研究[J].中华肺部疾病杂志:电子版,2015,8(4):431-435.
[13]欧莉梅,钟小宁,何志义,等.小剂量红霉素治疗稳定期慢性阻塞性肺疾病临床效果的研究[J].中国实用内科杂志,2010,30(12):1097-1100.
[14]张军,赵菲,卢翔,等.小剂量红霉素治疗减少COPD患者急性加重的作用[J].中国医学工程,2014,22(4):16-19.
[15]DIAMOND B J,BAILEY M R.Ginkgobiloba:indications,mechanisms,and safety[J].Psychiatr Clin North Am,2013,36(1):73-83.
[16]刘鑫,王小莉,胡耀明,等.FIZZ1在COPD大鼠肺组织中的动态表达[J].中国现代医学杂志,2013,23(4):9-13.
[17]WAN R F,HUANG Z H,JING K,et al.Azithromycin attenuates pulmonary inflammation and emphysema in smoking-induced COPD model inrats[J].Respiratory Care,2015,60(1):128-134.
[18]刘忠,刘馨,许国岩,等.银杏叶提取物对慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者白细胞介素-8和肿瘤坏死因子-α的影响[J].中国生化药物杂志,2011,32(6):482-484.
[19]刘忠.银杏叶提取物对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠ET-1、TGF-β1的影响[J].中国药房,2011,22(43):4051-4053.
[20]楼黎明,胡丹丹,董浙清,等.AECOPD患者细胞黏附分子变化及其临床意义的研究[J].现代实用医学,2011,23(5):501-506.
Effect ofGinkgo bilobaextract on pulmonary ultrastructures of rats with chronic obstructive pulmonary disease*
Ling Pan,Zhen Deng,Yu-ping Tan,Hong-mei Yang,Yi-bao Yang,Wei Liang,Rui-xiang Li
(Ruikang Hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning,Guangxi 530011,China)
Objective To study the intervention effect ofGinkgo bilobaextract (GBE)on thepulmonary ultrastructural changes in rats with chronic obstructive pulmonary disease(COPD).Methods Ninety Wistar rats were randomly divided into normal control group(group A),COPD control group(group B),early-stage GBE treatment group (group C),late-stage GBE treatment group (group D),Erythromycin early-treatment group(group E),and Erythromycin late-stage treatment group (group F).Six rats were randomly seleted from each group,ultrastructural changes of the lungs were observed by transmission electron microscopy,and the rates of pathological changes of mitochondria were calculated.Results The groups B,C,D,E and F all showed characteristic pathological changes of COPD to different extent.Under the transmission electron microscope,the ultrastructures in the groups C,D,E and F were more complete than those in the group B,and the rates of mitochondrial lesions were conspicuously lowered in the treatment groups,suggesting that GBE had a positive therapeutic effect.Conclusions GBE has inhibitory effects on airway and vascular remodeling in rat model of COPD.
chronic obstructive pulmonary disease;Ginkgo biloba extract;ultrastructure;rate of mitochondrial lesion
R541.5
A
10.3969/j.issn.1005-8982.2017.26.001
1005-8982（2017）26-0001-06
2017-01-11
国家自然科学基金（No：81260005）
谭玉萍，Tel：0771-2326770；E-mail：tanlaoshi1226@126.com
（童颖丹 编辑）
