复方中药治疗流行性腹泻病毒感染猪的消化道黏膜电镜观察及相关酶检测

杨云乔+郑建高+姜军华+黄旭伟+汤里平+尚秋辰+谢鑫峰+张友敏+金文杰+许小琴

摘要：选取12～20日龄感染流行性腹泻病毒腹泻猪，采用复方中药和西药抗生素进行临床治疗，治疗结束后取胃底部、十二指肠中段、空肠中段、回肠中段和结肠中段，通过场发射扫描电镜和透射电镜对比观察消化道病变；取回肠，通过免疫组化法检测琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶、5′-核苷酸酶和Na+-K+-ATP酶活性变化。场发射扫描电镜观察结果表明，中药治疗猪未见异常，西药治疗猪十二指肠黏膜表面见少量黏附的大肠杆菌。透射电镜观察结果表明，中药治疗猪细胞结构接近正常，无严重细胞损伤，但细胞微丝管、骨架等结构不如健康猪清晰；西药治疗猪消化道可见内质网损伤，内质网和高尔基体断裂，核形态和核染色质异常。琥珀酸脱氢酶、单胺氧化酶和Na+-K+-ATP酶检测结果均为中药治疗猪酶活性显著高于西药治疗猪。由结果可以推测，复方中药治疗猪流行性腹泻的良好效果可能与保护线粒体、稳定细胞结构、稳定膜结构、调整酶活性和抗继发感染有关。

关键词：猪流行性腹泻；复方中药；消化道黏膜；电镜观察；琥珀酸脱氢酶；单胺氧化酶；Na+-K+-ATP酶

中图分类号： S858.285.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0159-05

通信作者，许小琴，博士，教授，主要从事中兽医学相关研究。E-mail：xuxq@yzu.edu.cn。猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，简称PED）是猪病毒性腹泻病，可引起仔猪高死亡率、成年猪掉膘和饲料报酬率降低，给养猪业带来巨大的经济损失。目前对PED的防治主要通过接种疫苗、注射卵黄抗体和应用传统西药，但效果较差，因此，应用中药治疗PED成为热门的研究方向。笔者所在实验室之前的研究结果（未见刊）表明，中药治疗组平均442 d治愈，治愈率达86.67%，复发率为0，体质量最大下降0.59%，11 d增质量22.44%；西药对照组平均4.91 d治愈，治愈率达84.61%，复发率为7.69%，体质量最大下降508%，与中药组相比差异性极显著（P<0.01），11 d增质量20.94%，证实复方中药治疗可使猪群在PED疫情出现时较西药疗法掉膘少、恢复快、复发率低和增质量迅速稳定，从而减少养殖损失，本试验将探究其作用机制。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1药物、试剂和仪器中药材：80 g白头翁、80 g黄芩、50 g秦皮、60 g党参、50 g苍术、30 g甘草、40 g当归、50 g肉桂、50 g厚朴、60 g诃子、50 g山楂，均购自江苏省溧阳市时珍中医药有限公司。

庆大霉素、环丙沙星、乙酰甲喹、林可霉素，均购自上海公谊兽药厂。

抗体试剂：Mouse/Porcine 5′-Nucleotidase/CD73 Affinity Purified PAb（25 μg）、Donkey Anti-Sheep IgG HRP Affinity Purified PAb（1 mL），均購自美国R&D Systems Inc；ANTI-Na+/K+ATPASE，α1 50 μg，购自德国达姆施塔特默克集团；Mouse IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗小鼠来源）]、Rabbit IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗兔来源）]，均购自中国福麦斯生物技术有限公司；琥珀酸脱氢酶复合体B亚基抗体（SDHB Antibody）（FL-280）、单胺氧化酶A/B抗体（MAO-A/B Antibody）（H-50），均购自美国Santa Cruz公司。

仪器：RM2016轮转式切片机、13395H2X显微镜和EM CPD300全自动临界点干燥仪，均购自德国莱卡集团；108Auto高性能离子溅射仪，购自英国Cressington Scientific Instruments Ltd；S-4800II场发射扫描电镜，购自日本日立集团；CM100透射电子显微镜，购自荷兰飞利浦集团；101C-2型电热鼓风干燥箱，购自上海昕仪仪器仪表有限公司；BCD-290 W冰箱，购自中国海尔集团。

1.1.2试验动物选择江苏省溧阳市某猪场仔猪按常规免疫程序接种疫苗的12～20日龄腹泻仔猪，取肛门拭子经扬州大学微生物实验室检测，猪流行性腹泻病毒检出率为40%，猪轮状病毒和猪传染性胃肠炎病毒均为阴性。

选择1头江苏省仪征市某无腹泻疾病流行史猪场23日龄健康仔猪，取肛门拭子经扬州大学微生物实验室检测，猪流行性腹泻病、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒均为阴性，作为健康对照猪。

1.2试验方法

1.2.1分组和用药情况从溧阳市该猪场取56头腹泻仔猪按同窝，以及质量、日龄相近的原则分成2组，其中30头用中药治疗，26头用西药治疗。复方中药加水煎煮2次合并滤液浓缩到 1 000 mL 后灌服，0.75 mL/kg，2次/d，使用前加热至25～30 ℃；西药则肌肉注射0.75 mL/kg庆大霉素、0.75 mL/kg 林可霉素、0.15 mL/kg乙酰甲喹（猪场兽医习惯用法）。

1.2.2采样方法各取1头经过中药治疗和西药治疗5 d后基本痊愈的猪[治疗前猪流行性腹泻病毒（PEDV）检测呈阳性]，另取1头治疗失败的猪（治疗前PEDV检测呈阳性，西药治疗5 d后改用中药治疗3 d，病情未出现好转）和1头健康的猪，放血扑杀解剖。每头猪各取胃底部、十二指肠中段、空肠中段、回肠中段和结肠中段，用4 ℃磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗干净肠道内容物和黏膜面上的黏液，随后用双面刀片切成1 mm×1 mm大小的样品，用2.5%戊二醛固定，供电镜观察。每头猪取回肠中段2 cm，用10%中性福尔马林固定并制成蜡块，供免疫组化检测。

1.2.3场发射扫描电镜观察黏膜组织经PBS清洗后，乙醇梯度脱水、临界点干燥、粘样、喷金，置于S-4800Ⅱ场发射扫描电镜上观察肠道黏膜上皮细胞表面的超微结构。endprint

1.2.4透射电镜观察黏膜组织经PBS清洗后，经锇酸固定、清洗、脱水、包埋、切片、染色，用透射电镜CM-100（80 kV）观察肠道黏膜上皮细胞的细胞器结构损伤变化。

1.2.5免疫组化二氨基联苯胺（DAB）显色检测消化道酶的含量变化组织制成蜡块后进行切片、常规脱蜡、灭活、抗原修复、加一抗、加二抗、DAB显色，每张切片设未加一抗的阴性对照。从每张切片中选取5个典型视野并拍照，用Image-Pro Plus 5.0.1图像分析系统对指定检测的酶进行定量分析，结果以平均光密度值（MOD）表示。

抗体条件：琥珀酸脱氢酶复合体B亚基检测，一抗选用200倍稀释的SDHB Antibody（FL-280），二抗和DAB显色系统选用Rabbit IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗兔来源）]。单胺氧化酶检测，一抗选用100倍稀释的MAO-A/B Antibody（H-50），二抗和DAB显色系统选用Rabbit IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗兔来源）]。5′-核苷酸酶检测，一抗选用300倍稀释的Mouse/Porcine 5′-Nucleotidase/CD73 Affinity Purified PAb（25 μg），二抗选用400倍稀释的Donkey Anti-Sheep IgG HRP Affinity Purified PAb（1 mL），DAB显色系统选用Rabbit IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗兔来源）]。Na+-K+-ATP酶检测，一抗选用300倍稀释的ANTI-NA+/K+ATPASE，α1 50 μg，二抗和DAB显色系统选用Mouse IHC Kit[免疫组化试剂盒（一抗小鼠来源）]。

1.3数据分析

本试验所有数据均采用SPSS 20.0软件统计，并进行方差分析，统计结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05表示差异性显著。

2结果与分析

2.1场发射扫描电镜观察结果

中药治疗猪：消化道黏膜未见异常损伤，肠黏膜细胞微绒毛长度一致，排列整齐、均匀、致密（图1-a、图2-a）。

西药治疗猪：十二指肠黏膜微绒毛顶端出现不同程度的膨大，黏膜面偶见少量大肠杆菌，单个或成团。空肠黏膜微绒毛略为稀疏，其他未见异常（图1-b、图2-b）。

治疗失败猪：胃黏膜上皮细胞短棒状微绒毛和小隆起消失。十二指肠黏膜微绒毛顶端出现不同程度的膨大。空肠微绒毛虽没西药治疗猪空肠微绒毛稀疏，但是微绒毛顶端分叉、膨大，而且黏液较多。回肠黏膜上覆盖着大量大肠杆菌（图1-c）。结肠黏膜有损伤，隐窝数量减少，隐窝凹陷加深、直径增大（图2-c）。

健康猪：和中药治疗猪类似，消化道黏膜未见异常损伤，肠黏膜细胞微绒毛长度一致，但细节较多，黏膜表面结构更为清晰（图1-d、图2-d）。

2.2透射电镜观察结果

中药治疗猪：胃黏膜細胞无明显病变，膜结构清晰，核形态正常。十二指肠黏膜细胞微绒毛排列紧密，结构清晰，长度一致，微绒毛基底清晰完整，胞内结构完整，无明显病变。空肠和回肠黏膜细胞微绒毛结构完整，细胞间结构区分性良好，细胞核多呈圆形，细胞核多呈圆形，细胞微丝管、骨架等结构清晰度优于西药治疗猪，但偶见巨噬细胞，少量线粒体出现损伤。中药治疗猪结肠出现黑色泡状物体，内质网紧贴细胞核，膜结构清晰完整。

西药治疗猪：胃无明显病变。十二指肠上皮细胞偶见内质网破裂。空肠和回肠偶见内质网肿胀、间隙增宽，内质网和高尔基体出现断裂，核形态和核染色质异常。结肠偶见核膜不清晰和染色质异常。

治疗失败猪：胃黏膜细胞表面凸起脱落，黏膜损伤严重。胞内可见凋亡小体，线粒体形态不规则、崩解，核糖体从内质网脱落，内质网肿胀，核呈多形性，出现巨核、双核、多核或奇异形的核，核膜完整性降低。十二指肠黏膜细胞微绒毛偶见损伤，胞内膜结构模糊，底部可见大量线粒体聚集，部分线粒体出现破裂，下层胞内可见凋亡小体，膜结构完整性降低，胞间出现融合现象。空肠黏膜细胞胞浆内可见典型冠状病毒颗粒，直径120 nm（图3-a，箭头所示），呈圆形、椭圆形或梭形，纤突长而稀疏，有1个电子透明中心，同时可见未组装成熟的病毒粒子，微绒毛变短、散乱、脱落，基底完整性差（图3-b），细胞膜出现断裂，胞内出现多量空泡，偶见大量黑色颗粒聚集，围绕细胞核或在核旁一侧，组织深层可见大量炎症细胞浸润，以淋巴细胞为主，并有大量浆细胞和少量嗜酸粒细胞。回肠细胞出现核浓缩、核碎裂（图4-a），微绒毛上黏附大量大肠杆菌（图4-b），黏膜面可见吞噬细胞。结肠黏膜细胞线粒体损伤、破碎，胞内可见凋亡小体，微绒毛稀疏、变短，并出现分泌腺泡损伤。

健康猪：胃黏膜细胞结构完好，细胞内微丝管、细胞骨架比其他3头猪多，核多呈圆形、椭圆形或梭形。十二指肠黏膜细胞下层线粒体数量较多，细胞内微丝管、细胞骨架等结构较其他3头猪明显。空肠和回肠黏膜细胞线粒体大小相近，无线粒体肿胀现象，细胞内多种膜结构清晰可见，核膜完整，核大小相近，微绒毛排列紧密一致，基底部完整性良好。结肠未见异常。

2.3免疫组化DAB显色检测回肠多种酶含量的变化

由表1可知，各组4种酶活性均有不同程度的变化，且所有阴性对照无阳性信号。琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，简称SDH）主要表达在黏膜下层基底部，细胞浆内偶见阳性信号（图5），健康猪的琥珀酸脱氢酶活性高于中药治疗猪，两者差异不显著，中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的琥珀酸脱氢酶活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异显著（P<005）。单胺氧化酶主要表达在黏膜下层基底部，细胞浆内偶见阳性信号，健康猪的单胺氧化酶活性高于中药治疗猪，两者差异不显著，中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的单胺氧化酶活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异极显著（P<0.01）。5′-核苷酸酶主要表达在细胞浆内，健康猪、中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的5′-核苷酸酶活性依次递减，组间差异不显著。Na+-K+-ATP酶主要表达在细胞浆内， 细胞膜表达量表1复方中药和西药治疗流行性腹泻病毒感染猪的回肠多种酶活性（MOD）变化情况endprint

较少。健康猪、中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的 Na+-K+-ATP酶活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异极显著（P<0.01）。

3讨论

PEDV感染细胞后，利用宿主细胞的物质基础进行复制活动，细胞出现应激反应：核染色质增多、细胞质内核蛋白颗粒和核糖体数量增加、细胞活力和功能增强，以维护自身系统代谢所需。随着疾病发展，病毒对宿主细胞结构造成损伤，出现核浓缩、核碎裂等病理形态，导致细胞凋亡，呈现肠黏膜损伤，微绒毛变短、断裂、散乱，基底完整性降低，线粒体肿胀、溶解、崩解、破裂、脊结构模糊或消失。遇秀玲等的研究结果表明，PEDV病毒粒子存在于胞浆内而不是核內[1]。赵珊珊的研究表明，猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）强毒株导致IPEC-J2细胞发生严重病变，广泛引起细胞微绒毛散乱、脱落、部分膨大形成蘑菇化，细胞微结构和骨架散乱、消失，细胞内部线粒体、高尔基体、内质网等双层膜结构消失而出现空泡状或“U”形的单层膜结构，细胞核体积变大、内外核膜分离、核固缩[2]。高君恺的研究表明，PEDV感染猪小肠上皮细胞后可影响微丝管等细胞骨架，影响相邻细胞的紧密连接[3]。本试验结果与上述研究的结果一致。

根据笔者实验室此前的研究结果（尚未发表），取经腹腔注射大肠杆菌O101株后急性死亡的小鼠小肠组织进行扫描电镜观察，可见小肠绒毛上皮细胞严重剥落，基底部暴露，损伤严重；取自然感染犬细小病毒后急性死亡的幼犬小肠进行扫描电镜观察，同样可见上述类似病理变化。本试验未出现类似病变，而且肠微绒毛也有较为完整的区域，扫描电镜下可见微绒毛顶端虽有损伤但长度和其他组相比无明显缩短，推测可能是由于治疗失败组的猪解剖时已经是出现腹泻症状的第8天，属于转归期，而且经过中药治疗，方剂的君药白头翁具有一定的黏膜修复作用[4]，因此肠黏膜损伤情况可以得到减缓，或损伤的黏膜细胞已经重新长出。另外，一般来说猪流行性腹泻引起仔猪病变仅限于小肠[5]，且没有直接证据证明PEDV亚洲株病毒可以在结肠中复制[6]。但本试验中，治疗失败猪的结肠中同样存在着严重的病变。这可能是因为治疗失败猪病程较长，消化酶活性的降低和脱落的黏膜细胞及内容物腐败发酵，肠腔内pH值和浓度发生改变，当变质的内容物流经并持续刺激结肠时，即引起结肠黏膜损伤。中药治疗猪的肠黏膜细胞器病理损伤情况以及细胞微丝管、骨架等结构清晰度优于西药治疗猪，但不如健康猪，可推测中药治疗猪预后良好，完全康复还需一段时间，而西药治疗猪有复发的可能。

琥珀酸脱氢酶在真核生物中结合于线粒体内膜，可为真核细胞线粒体需氧和产能的呼吸链提供电子，其比活性可以反映细胞氧化磷酸化供能情况，是三羧酸循环运行的评价指标，即SDH活性越高，线粒体产生三磷酸腺苷（ATP）的能力越强[7-10]。消化道是机体重要的器官，体积大，血管网络丰富，集分泌、肌肉运动、消化、吸收等物质交换活动和免疫功能于一体，所需能量要求较高。本试验结果显示，琥珀酸脱氢酶复合体B亚基蛋白主要表达在黏膜下层基底部，细胞浆内偶见阳性信号，健康猪的酶活性高于中药治疗猪，两者差异不显著，中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的琥珀酸脱氢酶活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异显著（P<0.05）。可知，仔猪感染PEDV后回肠ATP产能降低，治疗后有所好转。中药治疗猪回肠SDH活性比西药治疗猪高，这可能与复方中药具有线粒体保护作用有关。

生物体内的单胺系含有苯乙胺结构的化合物。主要有多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素、β-苯乙胺、肾上腺素和酪氨酸等，它们许多都具有较强的生理活性。单胺氧化酶可使多种胺类氧化脱氨，从而具有调节生物体内胺浓度的功能。MAO广布于体内多种组织器官，尤以肝、肾、胃和小肠中含量最多[11-15]。本试验结果显示，健康猪的MAO活性高于中药治疗猪，两者差异不显著，中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的MAO活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异极显著（P<0.01）。治疗失败猪和西药治疗猪回肠MAO活性极显著低于健康猪，导致单胺类物质体内聚集过多，出现精神和生理的异常，如狂躁、精神紧张、呼吸系统和消化系统紊乱等现象[16-17]，造成耗能过多，影响治疗。

Na+-K+-ATP酶是存在于细胞及细胞器生物膜上的一种蛋白酶，它能够水解ATP为二磷酸腺苷（ADP），释放磷酸基而产生能量。Na+-K+-ATP酶在物质运送、能量转换、信息传递、维持细胞膜的完整及组织代谢等方面具有重要作用，可作为代谢紊乱和损伤组织恢复能力评价的可靠指标。肠黏膜屏障结构和功能的完整很大程度上依赖Na+-K+-ATP酶来维持，因此，肠黏膜细胞Na+-K+-ATP酶活性亦能间接反映肠黏膜的屏障功能。仝钢等用TGEV感染猪小肠黏膜上皮细胞，发现攻毒组Na+-K+-ATP酶活性与对照组相比显著降低[18]。张贵海发现转移性结直肠癌细胞Na+-K+-ATP酶活性下降从而提高侵袭力[19]。范颖等认为，黄芪、黄芪黄酮及含黄芪黄酮的有效部位能够降低糖尿病大鼠的血糖，其机制可能与改善Na+-K+-ATP酶活性、上调一磷酸腺苷依赖的蛋白激酶（AMPK）水平及蛋白表达有关[20]。本试验检测结果显示，Na+-K+-ATP酶α1亚蛋白主要在细胞浆内表达，细胞膜表达量较少，健康猪、中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的Na+-K+-ATP酶活性依次递减，且健康猪、中药治疗猪与西药治疗猪、治疗失败猪之间的酶活性差异极显著（P<0.01），结合场发射扫描电镜结果，表明中药治疗PEDV感染猪可通过调整Na+-K+-ATP酶活性、稳定膜结构以发挥作用。因此，中药治疗猪出现良好的抗继发感染效果，西药治疗猪则无此作用，复发和继发感染的概率较大。

5′-核苷酸酶有多种类型，目前发现的有6种，即膜结合性5′-核苷酸酶、胞浆-5′-核苷酸酶Ⅰ型、胞浆-5′-核苷酸酶Ⅱ型、胞浆-5′（3′）脱氧核糖核苷酸酶、线粒体-5′-核苷酸酶和仅存在于红细胞中的嘧啶核苷酸酶[21-23]。5′-核苷酸酶不仅具有水解酶的活性，而且具有重要的非水解酶活性，在细胞生长发育、运动、纤维蛋白合成、神经传递、提高表皮或内皮屏障功能及淋巴细胞的黏附、再循环、免疫应答等方面均发挥重要的作用[24]。本试验结果显示，5′-核苷酸酶主要在细胞浆内表达，健康猪、中药治疗猪、西药治疗猪和治疗失败猪的5′-核苷酸酶活性依次递减，组间无显著性差异，说明PEDV虽然对细胞结构和细胞连接有明显的损伤，但可能与5′-核苷酸酶的关联性不高，需要进一步研究。endprint

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