克痹宁凝胶剂对佐剂性关节炎大鼠的抗炎作用

陶新知，徐志立，王素娟，李洋杨，何思雨，管锡昆，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

克痹宁凝胶剂对佐剂性关节炎大鼠的抗炎作用

陶新知，徐志立，王素娟，李洋杨，何思雨，管锡昆，张明波 （辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的：探讨克痹宁凝胶剂对佐剂性关节炎大鼠的抗炎作用.方法：建立完全弗氏佐剂诱导的关节炎大鼠模型，测定继发性足趾肿胀、关节炎指数、棉球肉芽肿、血清一氧化氮含量，并观察克痹宁对关节炎大鼠踝关节组织形态学的影响.结果：克痹宁治疗后，佐剂性关节炎大鼠的继发性足肿胀、关节炎指数、棉球肉芽肿质量及一氧化氮含量均明显下降，病理结果显示，关节炎大鼠踝关节组织水肿及淋巴细胞浸润明显减轻.结论：克痹宁可降低佐剂性关节炎大鼠血清中异常增高的一氧化氮含量，抑制类风湿关节炎（RA）的炎症症状.

克痹宁凝胶剂；佐剂性关节炎；抗炎

0 引言

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）为全球分布的异质性、系统性、自身免疫性疾病，主要临床表现为对称性多关节炎，是使人类丧失劳动力和致残的主要疾病之一［1］.RA的发病原因仍未完全清楚，目前尚无根治药物及根治方案，治疗目的主要是缓解症状，保持关节功能，提高生活质量.常用的药物包括非甾体类抗炎药（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）、慢作用抗风湿药（slow⁃acting antirheumatic drugs，SAARDs）及糖皮质激素类（glucocorticoid，GC）［2］.虽然各类药物对RA的临床症状均有不同程度的缓解，但长期用药后会发生如消化道溃疡、骨髓抑制、免疫力低下、肝肾损害及心脏毒性等多种不良反应，从而导致治疗中断、治疗失败甚至药源性疾病.

中医药治疗RA疗效确切，不良反应少，具有独特的优势.中医辨证之“痹证”的临床表现，西医学中的风湿性、类风湿性关节炎、骨关节炎、反应性关节炎等均属于本病的范畴.“痹证”是因机体感受风寒湿热之邪，闭阻经络，气血运行不畅等引起的病证，主要症状为肢体关节疼痛、肿胀、酸楚、麻木、重着以及活动不利等［3］.关于治疗RA的中药及方剂的药理作用及作用机制研究始终是中医临床与基础研究的热点，近年来采用中药复方综合治疗取得了较大进展，在缓解症状、改善证候方面具有不可替代的临证价值［4］.

克痹宁凝胶剂来源于由独活、杜仲、桑寄生、威灵仙、丹参等15味中药组成的临床验方，在此基础上辽宁中医药大学药学院采用现代工艺将其制备为使用方便、价廉、安全、稳定的中药凝胶制剂.为考察克痹宁凝胶剂对RA的治疗活性，本研究采用经典的完全弗氏佐剂（complete Freund's adjuvant，CFA）诱导大鼠佐剂性关节炎（adjuvant⁃induced arthritis，AA）结合风、寒、湿刺激，制备AA大鼠动物模型［5］，观察克痹宁凝胶剂对RA的抗炎作用，为其进一步开发与临床应用提供药理学依据.

1 材料和方法

1.1 实验动物SD大鼠60只，雌雄各半，体质量220～240 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，许可证号：SCXK（辽）2010⁃0001.动物饲养条件：清洁级环境饲养，温度（22±2）℃，相对湿度40%～60%，控制照明时间为14 h.适应两周后开始实验.

1.2 药品与试剂方中药材（杜仲、桑寄生、威灵仙、丹参、地龙、生地、木瓜、乌梢蛇、三七、独活、红花、白芍、鸡血藤、当归、蜈蚣）购自大连市国药大药房，经辽宁中医药大学中药鉴定教研室王荣祥教授鉴定为正品.干燥药材分别经醇提（白芍、杜仲、威灵仙、桑寄生、丹参、三七、独活、红花）或水提（生地、地龙、鸡血藤、当归、蜈蚣、乌梢蛇、木瓜）后，由旋蒸仪浓缩，与配制的凝胶基质均匀混合，制备为每100 g凝胶剂中含有30 g生药的新型中药凝胶剂.

完全弗氏佐剂（Sigma，SLBM9312V）；一氧化氮（NO）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，20161112）.

1.3 仪器MR⁃96A酶标仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；UV⁃5600紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；MA240D型电子分析天平（上海第二天平仪器厂）；TG⁃16W型台式离心机（长沙湘仪离心机有限公司）.

1.4 方法

1.4.1 动物分组及AA大鼠模型建造［6－8］随机选出10只SD大鼠作为正常对照组，其余均用于造模.禁食12 h后，除正常对照组外，其余大鼠置于4℃～8℃冷水中，水面高度2 cm，30 min后取出，电风扇吹干大鼠身体，然后于大鼠右后足垫皮内注射CFA，0.1 mL/只，正常组大鼠注射等体积生理盐水，连续2 d.致炎后9 d大鼠左后足相继出现继发性关节炎症状（非致炎及双前肢的关节红肿），精神萎靡、毛发松散，表明AA大鼠模型建造成功.选出造模成功大鼠40只，按体质量分层随机分为4组，每组10只，分别为正常对照组，模型对照组，高、中、低剂量组（1.2、0.6、0.3g/kg）.给药组大鼠四肢涂抹新型中药凝胶剂，正常组及模型对照组大鼠四肢涂抹凝胶基质.1次/d，连续28 d.

1.4.2 AA大鼠一般体征及关节炎指数（arthritis index，AI） 测定并观察造模及给药前后大鼠体毛色泽、神志、四肢活动、食量增减、体质量变化.测定AI：大鼠给药后3 d（佐剂致炎后12 d）开始观察记录大鼠四肢关节病变程度，根据文献［9－10］记录临床评分.0分：无红肿；1分：单个趾关节明显红肿；2分：数个足趾关节明显红肿；3分：整个足及足跖关节明显红肿；4分：严重的关节肿胀或变形.

1.4.3 AA大鼠棉球肉芽肿形成的测定［11］给药后第18天，各组大鼠乙醚麻醉，背部正中线一侧切约1 cm长小口，将20 mg高压灭菌棉球从切口处植入皮下，缝合，青霉素浸润伤口.第28天处死大鼠，打开切口取出棉球联通周围结缔组织，剔除脂肪组织，70℃烘干，分析天平称重.

1.4.4 AA大鼠的继发性对侧足肿胀度测定［12］分别在给药后第14天（致炎后第23天），第28天（致炎后第37天）测定继发性的左后足肿胀.肿胀率（%）＝（给药后足掌厚度－给药前足掌厚度）/给药前足掌厚度×100%.

1.4.5 AA大鼠血清中NO含量测定［13］末次给药2 h后，各组大鼠眼眶后静脉丛采血，离心取上清，按试剂盒说明书要求测定血清中NO含量.

1.4.6 AA大鼠踝关节组织形态学观察［14］末次给药2 h后，各组大鼠处死，取下包括踝关节在内的整个右后足，4%多聚甲醛固定48 h，10%硝酸脱钙完全后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，HE染色，显微镜下观察病理变化.

1.5 统计学处理采用IBM SPSS21.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 克痹宁对AA大鼠一般症状及关节炎指数的影响在免疫初期，大鼠饮食量、精神状态、自主活动等无明显改变，免疫后12 d（给药3 d），模型大鼠四肢从足趾部分开始出现红、肿等炎症表现，关节炎指数显著升高（P＜0.01）.免疫16 d（给药7 d）后大鼠四肢持续严重肿胀，部分大鼠在尾部、耳部出现炎症小结，后肢关节硬化，并逐渐丧失运动功能，体质量增长减慢.连续给药14 d、21 d及28 d后，高、中剂量组大鼠关节炎指数明显下降（P＜0.05，P＜0.01，表1），表明克痹宁可显著抑制AA大鼠的关节炎症状.

表1 克痹宁对AA大鼠关节炎指数的影响（±s，n＝10）

表1 克痹宁对AA大鼠关节炎指数的影响（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常对照组；aP＜0.05 vs模型对照组；dP＜0.01 vs模型对照组.

组别关节炎指数（分）给药3 d给药7 d给药14 d给药21 d给药28 d正常对照组0.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.00.0±0.0模型对照组6.2±1.2b8.1±1.0b9.8±2.0b9.5±1.2b8.8±0.8b高剂量组6.1±1.68.0±1.17.2±1.2d5.4±1.6d4.1±1.4d中剂量组6.1±1.57.9±0.98.4±1.4a6.9±1.2d5.6±0.8d低剂量组6.2±1.07.8±0.89.3±1.88.6±1.37.7±1.4

2.2 克痹宁对AA大鼠继发性对侧足肿胀的影响各组AA大鼠给药后14 d、28 d均出现继发性左后足肿胀，与正常组比较差异具有统计学意义（P＜0.01），AA大鼠给予1.2、0.6 g/kg的克痹宁14 d、28 d后，继发性足肿胀显著减轻，差异具有统计学意义（P＜0.01，表2）.

表2 克痹宁对AA大鼠继发性对侧足肿胀的影响（±s，n＝10）

表2 克痹宁对AA大鼠继发性对侧足肿胀的影响（±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常对照组；dP＜0.01 vs模型对照组.

组别给药前左后足掌厚度（mm）给药后左后足掌肿胀率（%）14 d28 d正常对照组5.17±0.331.13±0.241.37±0.43模型对照组5.25±0.4526.23±7.03b20.77±6.00b高剂量组5.29±0.3713.23±4.15bd8.92±1.56bd中剂量组5.26±0.2915.69±3.30bd12.87±4.20bd低剂量组5.27±0.3420.59±2.99b17.90±2.76b

2.3 克痹宁对AA大鼠棉球肉芽肿形成及NO含量的影响AA大鼠给予克痹宁后，肉芽肿形成受到明显抑制（P＜0.01），高、中剂量克痹宁可显著抑制AA大鼠血清中NO含量（P＜0.01）.

表3 克痹宁对AA大鼠棉球肉芽肿形成及NO含量的影响（ ±s，n＝10）

表3 克痹宁对AA大鼠棉球肉芽肿形成及NO含量的影响（ ±s，n＝10）

bP＜0.01 vs正常对照组；dP＜0.01 vs模型对照组.

组别肉芽肿重量（mg）NO含量（μmol/L）正常对照组56.33±13.5426.94±6.94模型对照组127.99±6.77b68.61±12.70b高剂量组59.30±10.87d30.00±3.88d中剂量组69.94±22.85d42.78±8.61d低剂量组87.53±15.76d52.78±11.11

2.4 克痹宁对AA大鼠关节组织病理学变化的影响

正常大鼠踝关节滑膜无充血、水肿，滑膜皱褶处无淋巴细胞浸润；而模型组大鼠关节滑膜有明显的充血、水肿，滑膜皱褶处上皮细胞明显增生并见明显的淋巴细胞浸润.给予克痹宁治疗后，AA大鼠关节水肿及淋巴细胞浸润明显减轻（图1）.

图1 克痹宁对AA大鼠踝关节组织病理学变化的影响（HE×200）

3 讨论

RA是一种关节慢性炎症性、反复发作的全身疾病.AA是以关节滑膜组织的慢性增生为主要表现的免疫功能障碍性关节炎模型，其关节炎特征与人的RA较为接近［15］，因此多利用弗氏佐剂制备AA大鼠模型来考察RA治疗药物的活性.

RA受多种免疫细胞、炎症因子调控，疾病过程中存在多种细胞因子的合成和分泌异常.NO既是一种炎症细胞因子，亦是一种自由基.生理量的NO即介导和调节多种生理过程，过量的NO则造成组织损害.研究［16］表明，NO参与自身免疫疾病的组织破坏和炎症过程.NO可激活NF⁃κB途径，加速关节炎症的进程；也可直接参与自由基反应，直接导致软骨损害；亦可抑制蛋白多糖合成，增加PGE2的合成，引起关节疼痛并抑制软骨细胞增殖［17］.

本研究结果显示，克痹宁能降低CFA引起的AA大鼠足趾肿胀及关节炎指数，明显抑制AA大鼠棉球肉芽肿形成.组织病理学结果也表明，AA大鼠踝关节水肿及滑膜淋巴细胞浸润均明显减轻，提示克痹宁凝胶剂可通过抑制炎性细胞浸润改善AA的各种炎性症状.克痹宁明显降低AA大鼠血清中NO含量，表明克痹宁可能通过抑制AA大鼠体内NO合成发挥缓解AA的药理作用，有关其作用机制及物质基础仍需进一步研究.

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Anti-inflammatory effects of Kebining gel on adjuvant arthritis in rats

TAO Xin-Zhi，XU Zhi-Li，WANG Su-Juan，LI Yang-Yang，HE Si-Yu，GUAN Xi-Kun，ZHANG Ming-Bo
College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China

AIM：To investigate the anti⁃inflammatory effects of Kebining gel on adjuvant arthritis in rats.METHODS：The rat model of arthritis was established by subcutaneous injection of complete Freund's adjuvant and the therapeutic effects of Kebining gel on the foot swelling，arthritis index，cotton ball granuloma and serum nitric oxide contents were determined，respectively.Addi⁃tionally，the pathological changes of ankle joint in rats with arthri⁃tis were observed.RESULTS：After treatment with Kebining gel，foot swelling，arthritis index，cotton ball granuloma and serum nitric oxide contents were obviously decreased，and the edema and infiltration of lymphocytes in ankle joints were significantly reduced in arthritic rats according to the pathological findings.CONCLUSION：Kebining gel could reduce the nitric oxide con⁃tent，and then inhibit the inflammation of rheumatoid arthritis（RA）induced by complete Freund's adjuvant.

Kebining gel；adjuvant arthritis；anti⁃inflammation

R285.5

A

2017－06－14；接受日期：2017－06－29

2016年辽宁省省级大学生创新创业训练计划项目（201610162016）

陶新知.E⁃mail：1434537502＠qq.com

徐志立.博士，副教授，硕导.研究方向：中药药理学.E⁃mail：xu＿zhili＠126.com

2095⁃6894（2017）10⁃47⁃04