蒸汽爆破对豆渣中大豆异黄酮的影响研究

靳羽慧 刘长忠 徐 响 康芳芳 杨 伟 李 波

(河南科技学院1，新乡 453003)(中国农业科学院蜜蜂研究所2, 北京 100093)

蒸汽爆破对豆渣中大豆异黄酮的影响研究

靳羽慧1刘长忠1徐 响2康芳芳1杨 伟1李 波1

(河南科技学院1，新乡 453003)(中国农业科学院蜜蜂研究所2, 北京 100093)

采用高效液相色谱法研究蒸汽爆破处理对豆渣中大豆异黄酮组成和含量的影响。结果表明，豆渣经蒸汽爆破处理后，6种大豆异黄酮含量均显著增高，大豆苷、大豆苷元、黄豆黄苷、黄豆黄素、染料木苷、染料木素分别由汽爆前的3.69、11.22、0.84、2.76、2.13、27.45 μg/g增至38.04、74.96、15.75、23.36、20.36、66.28 μg/g。黄豆黄苷增幅最大，较汽爆前增高了17.75倍；染料木素增幅最小，较汽爆前增高了1.41倍。而且，大豆异黄酮的增幅随汽爆强度增加呈上升趋势，在汽爆压强2.0 MPa、维压时间30 s时达到最大值(黄豆黄苷为2.0 MPa、60 s)。研究表明，采用适宜的汽爆强度处理豆渣，能够显著提高大豆异黄酮含量，这为豆渣的开发利用提供了有益参考。

豆渣 蒸汽爆破 大豆异黄酮 高效液相色谱法

大豆异黄酮(Soybean isoflavones)是大豆中一类多酚化合物的总称，具有广泛的生物学活性，对心血管疾病、癌症、骨质疏松症、更年期综合征等有预防效果[1-4]。大豆异黄酮在大豆中以苷元和糖苷的形式存在，包括3种游离型异黄酮苷元和9种结合型糖苷。3种苷元为大豆苷元(Daidzein)、染料木素(Genistein)和黄豆黄素(Glycitein)；9种糖苷由3种苷元衍生而成，分别是葡萄糖苷型的大豆苷(Daidzin)、染料木苷(Genistin)和黄豆黄苷(Glycitin)，丙二酰基葡萄糖苷型的丙二酰基大豆苷(Malonyl Daidzin)、丙二酰基染料木苷(Malonyl Genistin)和丙二酰基黄豆黄苷(Malonyl Glycitin)，乙酰基葡萄糖苷型的乙酰基大豆苷(Acetyl Daidzin)、乙酰基染料木苷(Acety Genistin)和乙酰基黄豆黄苷(Acety Glycitin)[4-6]。

植物多酚具有许多功能特性，多以共价结合的形式存在于植物体的不同组织中。研究表明，热处理能够使多酚类化合物从共价结构中释放出来，从而提高了它们的功能特性。例如，柑橘皮经热处理后，可释放出一些低分子质量的多酚类化合物，从而增加柑桔皮的抗氧化能力[7-8]。蒸汽爆破(简称汽爆)是其中一种热处理方式，其原理是将原料置于高温高压的环境中，当瞬间解除高压时，原料空隙中的过热蒸汽迅速气化，体积急剧膨胀而使细胞破裂。汽爆技术迄今已有80多年历史，主要用于木质纤维的预处理，提高纤维素对酶及化学试剂的可及性[9]。汽爆对黄酮类化合物的影响研究迄今仅有少量报道。张兵兵等[10]报道，汽爆处理后，银杏叶黄酮提取率可提高2.1倍；张棋等[11]报道，粉葛经汽爆处理后，总黄酮提取量可增加1.3倍，且提取物抗氧化活性显著提高。

豆渣是大豆加工的副产物，约含有50%的膳食纤维和20%的蛋白质，还含有大豆异黄酮等其他营养功能成分[12]。我国每年约产生2 000万t豆渣，但其开发利用率很低，大都作为饲料或废弃物处理，既浪费资源，又污染环境。本试验将豆渣进行汽爆处理，采用高效液相色谱法(HPLC)研究汽爆处理条件对大豆异黄酮种类和含量的影响，以期为豆渣的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

湿豆渣来自加工豆腐、豆浆的副产物，由常州苏豆食品有限公司提供。湿豆渣经旋转闪蒸干燥后得豆渣粉，含水量为4.9%。6种大豆异黄酮标准品(大豆苷、染料木苷、黄豆黄苷、大豆苷元、染料木素、黄豆黄素)：上海源叶生物科技有限公司。乙腈和甲醇为色谱纯试剂，二甲基亚砜和乙酸为分析纯试剂。

SXG-4型旋转闪蒸干燥机：江苏宇通干燥设备厂；QBS-80超音速弹射式气爆机：鹤壁正道生物能源有限公司；Agilent1260 Infinity高效液相色谱仪：安捷伦公司；Quanta 200环境扫描电子显微镜：美国FEI公司。

1.2 试验方法

1.2.1 豆渣的汽爆处理

过40目筛的豆渣粉，分别采用不同压强(0.5、1.0、1.5、2.0 MPa)和维压时间(30、60、120 s)对其进行汽爆处理。汽爆豆渣在80℃烘干后粉碎，过40目筛备用。

1.2.2 样品处理

参照文献[6]的方法。精确称取1.000 0 g豆渣粉和汽爆豆渣粉，置于离心管中，加入5 mL乙腈和5 mL超纯水，密封后充分混匀，用摇床在250r/min 25 ℃下振荡提取2 h，然后在6 000 r/min下离心20 min，上清液用中速定性滤纸过滤。滤液在35 ℃旋转蒸发至干，加入3 mL 80%甲醇溶液以溶解干物质，采用0.45 μm有机系过滤器除去不溶物，滤液在-20 ℃下冷冻保存备用。

1.2.3 标准品处理

分别精确称取6种大豆异黄酮标准品10 mg，以1∶1∶2的比例(体积比)向其中加入二甲亚砜、乙腈和80%甲醇溶液，充分溶解标准品，配制成1 mg/mL的原始溶液。单一标准溶液的配制：使用80%甲醇溶液将原始溶液稀释成100 μg/mL的单标标准液。混合标准溶液的配制：等量吸取6种标准品原始溶液，混合，加入80%甲醇溶液配制成10、20、30、40、50 μg/mL不同质量浓度梯度溶液，以制作标准曲线。

1.2.4 高效液相色谱条件

Waters公司SunFireTMC18色谱柱，5 μm，4.6 mm×250 mm；柱温35℃；进样量10 μL；检测波长262 nm；流速1 mL/min。采用梯度洗脱，流动相A为含有0.1%乙酸的超纯水溶液，流动相B为含有0.1%乙酸的乙腈溶液，运行时间45 min，洗脱梯度见表1。

表1 洗脱梯度

1.2.5 扫描电镜观测

将过80目筛的汽爆豆渣在105 ℃干燥至恒重，取适量粘于样品台上，采用离子溅射方法镀金，然后用环境扫描电镜进行观测。

1.3 数据分析方法

试验数据由HPLC 1260 系统自动记录。数据采用Office Excel 2007进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 大豆异黄酮标准品的液相色谱分析

大豆异黄酮的检测方法有紫外分光光度法、HPLC法、液质联用法等[13-16]。其中，HPLC法具有分离效果好、准确度高、重现性好等优点，被广泛采用。

天然存在的大豆异黄酮分为3类，即大豆苷类、染料木苷类、黄豆黄素苷类，分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型、丙二酰基葡萄糖苷型4种形式存在[4]。其中，丙二酰基葡萄糖苷型和乙酰基葡萄糖苷型具有热不稳定性，在加热和碱性条件下可去掉丙二酰基和乙酰基转化为葡萄糖苷型。葡萄糖苷型异黄酮比较稳定，需在强酸、高温或酶存在下，才会水解掉葡萄糖基转化为苷元型异黄酮。有鉴于此，美国分析化学家协会(AOAC)测定方法中采用了6种大豆异黄酮标准品进行检测[17]。考虑检测工作的实效性，本研究选用3种苷元型异黄酮和3种葡萄糖苷型异黄酮作为标准品，它们的HPLC图谱见图1。结果显示，本研究所采用的分析方法能够将6种大豆异黄酮标准品很好的分离，且在一定范围呈良好的线性关系。

注：1-大豆苷，2-黄豆黄苷，3-染料木苷，4-大豆苷元，5-黄豆黄素，6-染料木素。下同。图1 大豆异黄酮标准品的HPLC色谱图

样品出峰时间/min回归方程R2大豆苷11．896y=32．461x-14．2000．9989黄豆黄苷12．769y=27．906x+27．8590．9945染料木苷18．345y=43．632x+23．9870．9961大豆苷元27．989y=46．270x+19．3160．9968黄豆黄素29．169y=46．719x+36．1560．9937染料木素35．157y=56．475x+22．9820．9965

2.2 豆渣中大豆异黄酮的检测

将湿豆渣旋转闪蒸干燥后得豆渣粉，采用HPLC法测定其大豆异黄酮含量，结果见图2。

图2 豆渣中大豆异黄酮的HPLC色谱图

图2显示，豆渣中含有至少6种大豆异黄酮。其中，染料木素和大豆苷元含量较多，分别为27.45、11.22 μg/g，其次是大豆苷、黄豆黄素和染料木苷，含量在2～3 μg/g之间，黄豆黄苷含量最少，仅有0.84 μg/g。分析结果表明，豆渣中仍含有一定数量的大豆异黄酮，且苷元型异黄酮含量较多，这可能与其水溶性较差有关。已有研究证实，只有苷元型异黄酮才能被人体直接消化吸收，而糖苷型异黄酮需经β-葡萄糖苷酶水解去除糖基后才能被吸收[18]。由此可见，豆渣中的大豆异黄酮生理功效较高，具有良好的开发利用价值。

据文献报道，大豆异黄酮对热比较敏感，热处理可导致黄豆、豆浆中的丙二酰基型异黄酮含量降低，而苷元型和糖苷型含量增加[19-20]。因而，湿豆渣经旋转闪蒸干燥制备豆渣粉的过程中，异黄酮的组成含量均可能会发生一些变化。

2.3 汽爆豆渣中大豆异黄酮的检测

采用蒸汽爆破处理物料，不仅能够破坏细胞壁，将小分子物质从细胞内释放出来，还能使膳食纤维等大分子物质发生降解[9]。因此，汽爆处理有可能对豆渣中的异黄酮也产生较大影响。本试验采用不同汽爆强度处理豆渣粉，研究其对大豆异黄酮种类和含量的影响，结果见表3。

表3 不同汽爆条件处理豆渣的大豆异黄酮种类和含量

分析结果显示，豆渣经汽爆处理后，6种大豆异黄酮含量均显著增加。其中，大豆苷由3.69 μg/g最高增至38.04 μg/g，大豆苷元由11.22 μg/g最高增至74.96 μg/g，黄豆黄苷由0.84 μg/g最高增至15.75 μg/g，黄豆黄素由2.76 μg/g最高增至23.36 μg/g，染料木苷由2.13 μg/g最高增至20.36 μg/g，染料木素由27.45 μg/g最高增至66.28 μg/g。增幅最大的是黄豆黄苷，其含量较汽爆前增加17.75倍；增幅最小的染料木素，其含量也增加了1.41倍。而且，汽爆压强和维压时间对大豆异黄酮含量有较大影响。随着汽爆强度增大，各种大豆异黄酮含量总体呈上升趋势，除黄豆黄苷在2.0 MPa、60 s含量最高外，其余5种大豆异黄酮均在2.0 MPa、30 s时含量达到最大值。在本试验设计条件下，汽爆压强的影响大于维压时间，压强增加后，异黄酮含量变化显著。在较低压强时，维压时间对异黄酮的影响趋势不显著，但当压强达到2.0 MPa时，异黄酮含量随维压时间延长呈下降趋势。

豆渣经汽爆处理后异黄酮含量增加的可能原因，一方面是豆渣细胞壁的完整性经汽爆后受到破坏，导致细胞内物质被释放出来，提高了大豆异黄酮的提取率。另一方面，豆渣中的膳食纤维发生降解和断裂，致使一些原来与这些大分子物质结合的大豆异黄酮转变为游离状态，从而易被溶剂提取出来。而且，汽爆强度越大，对细胞壁的破坏和对膳食纤维的降解程度越高，故而释放出来的大豆异黄酮数量越多。此外，蒸汽爆破时产生的高温高压环境可使丙二酰基葡萄糖苷型异黄酮和乙酰基葡萄糖苷型异黄酮转化为葡萄糖苷型异黄酮，从而使大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷含量增加。检测结果也显示，这3种葡萄糖苷型异黄酮的增幅高于3种苷元型异黄酮。

分析结果还显示，随着汽爆强度增加，杂质峰数量逐渐增多，这可能是因为在汽爆过程中形成了5-羟甲基糠醛等小分子物质[11]。当汽爆强度过大时，大豆异黄酮含量反而呈现下降趋势，这可能与过高的温度和压强使异黄酮氧化成半醌和醌结构，这类物质重新聚合形成不溶性聚集体或进一步与蛋白质或多糖共价结合有关[21-22]。

2.4 蒸汽爆破对豆渣微观结构的影响

扫描电镜观测(图3)显示，豆渣的微观结构呈较完整的片状结构。汽爆强度为1.0 MPa 30 s时，豆渣片状结构的边缘被破坏，形成很多小的碎片。汽爆强度为2.0 MPa 30 s时，片状结构完全消失，豆渣呈现较分散的颗粒状。汽爆强度为2.0 MPa 120 s时，小颗粒发生聚集，形成大的块状。豆渣经汽爆处理后，其片状结构的完整性遭受破坏，逐渐变成更多更小的颗粒，因而异黄酮容易被提取出来。当汽爆强度过高时，小颗粒发生聚集，导致异黄酮的提取率下降。

注：放大倍数均为2 000倍。图3 汽爆豆渣的扫描电镜图

3 结论

豆渣中染料木素、大豆苷元含量较高，生理功效较好。豆渣经汽爆处理后，6种异黄酮含量均显著增加，且随汽爆强度增加增幅呈上升趋势，在2.0 MPa、30 s时达到最大值(黄豆黄苷为2.0 MPa、60 s)。葡萄糖苷型异黄酮的增幅略高于3种苷元型异黄酮。研究结果表明，采用适宜的汽爆强度处理豆渣，能够显著提高大豆异黄酮含量，这为有效开发利用豆渣提供了新思路。

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Effect of Steam Explosion Treatment on Soybean Isoflavones of Okara

Jin Yuhui1Liu Changzhong1Xu Xiang2Kang Fangfang1Yang Wei1Li Bo1

(Henan Institute of Science and Technology1, Xinxiang 453003)(Institute of Apicultural Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences2, Beijing 100093)

The contents and components of soybean isoflavones of okara treated by steam explosion (SE) were determined by high performance liquid chromatography (HPLC). The results showed that the contents of six kinds of soybean isoflavones of okara increased distinctly after SE treatment. The contents of daidzin, daidzein, glycitin, glycitein, genistin and genistein raised from 3.69, 11.22, 0.84, 2.76, 2.13 and 27.45 μg/g to 38.04, 74.96, 15.75, 23.36, 20.36 and 66.28 μg/g after SE treatment, respectively. Glycitin content increased largest, 17.75 times higher than that before SE. Genistein content increased smallest, which was 1.41 times higher than that before SE. Furthermore, the enhancement of soybean isoflavones presented a rising trend with the increase of SE strength and maximum at the steam explosion of 2.0 MPa and pressure preserving time of 30 s (glycitin was 2.0 MPa 60s). This study suggested that the proper SE treatment could improve significantly the contents of soybean isoflavones of okara, which provided a useful reference for the development of okara.

okara, steam explosion, soybean isoflavones, HPLC

TS209

A

1003-0174(2017)10-0016-06

河南省科技创新杰出人才项目(2017JR0006)，河南科技学院2015年度重大培育项目(2015ZD01)

2016-10-12

靳羽慧，女，1994年出生，硕士，功能性食品

李波，男，1973年出生，教授，功能性食品