复合澄清剂对红树莓果酒的澄清效果研究

于润美，姜燕，张海悦，翟硕

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

复合澄清剂对红树莓果酒的澄清效果研究

于润美，姜燕*，张海悦，翟硕

（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

以红树莓为原料发酵酿造红树莓果酒，并将壳聚糖和皂土作为复合澄清剂，探究其澄清效果及稳定性。以红树莓果酒透光率为响应值，采用Box-Behnken中心组合试验和响应面分析法，研究复合澄清剂比例、水浴温度和水浴时间对红树莓果酒澄清效果的影响。结果表明复合澄清剂澄清红树莓果酒的最佳工艺参数为：壳聚糖和皂土的质量比为3∶1、水浴温度45℃、水浴时间35 min，在此条件下红树莓果酒透光率为91.26%，与响应面预测值91.32%拟合性较好，且酒体澄清透明，酒香浓郁，稳定性好。

红树莓；果酒；壳聚糖；皂土；澄清

树莓又称“覆盆子”，蔷薇科悬钩子属浆果植物，其性微温，味甘酸，肾经、归肝，具有补肝益肾、明目之功效[1]。树莓中含有丰富的糖、有机酸、维生素C及活性成分如鞣花酸、树莓酮和黄酮等，具有抗氧化、降血脂、抗癌、提高免疫力等作用[2]。以红树莓为原料，经过破碎、发酵、陈酿等工艺酿造的果酒，可以促进血液循环和身体的新陈代谢，达到护肝、抗衰老的目的。

树莓果酒中含有大量单宁、有机酸、果胶质等成分，大多以胶体形式存在，属于高度分散的热力学不稳定体系，使红树莓果酒在酿造过程中出现浑浊的现象，影响果酒的品质，需对红树莓果酒进行澄清处理[3]。常用的澄清剂有壳聚糖、皂土、明胶等。壳聚糖及其衍生物具有良好的絮凝、澄清作用，可使悬浮物迅速絮凝，自然沉淀，提高原液的得率；皂土是由天然膨润土精制而成的无机矿物凝胶，在酿酒和农业中用作稳定剂、澄清剂等；明胶可以吸附果酒中的负电荷使其相互聚集沉淀达到澄清的效果。目前，红树莓果酒澄清研究均采用单一澄清剂，对于复合澄清剂优化试验以及澄清后稳定性研究较少。本试验利用单因素和响应面优化试验确定最佳澄清方法，使澄清后的果酒透明，稳定性强，为红树莓果酒产品开发利用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓：吉林省白山市玖宏树莓种植基地；安琪葡萄酒果酒专用酵母：湖北省宜昌市安琪酵母有限公司；澄清剂（明胶、皂土）：郑州万搏化工产品有限公司；壳聚糖（脱乙酰度＞90%）：南通兴成生物制品厂；柠檬酸：潍坊英轩实业有限公司；白砂糖：市购。

1.2 主要仪器与设备

Varian Cary 50紫外可见分光光度计：驭锘实业上海有限公司；TG-16G台式高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；WNY-01酒精计：河北省沧州地区医药公司；PHS-3D型pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

红树莓→原料分级→清洗→打浆→糖酸调节→接种果酒酵母→发酵→陈酿→澄清→二次调配→罐装→杀菌→产品

1.3.2 澄清剂的制备方法

2%明胶溶液：准确称取2 g明胶，置于98 mL蒸馏水中浸泡24 h，缓慢加热溶解，边加热边搅拌，配成2%明胶，静置冷却备用。

2%皂土溶液：准确称取2 g皂土，置于98 mL蒸馏水中浸泡24 h，使其充分吸水膨胀，搅拌制成2%皂土悬浮液备用。

2%壳聚糖溶液：准确称取1 g柠檬酸，将其加入在97 mL蒸馏水中搅拌直至溶解，再加入2 g壳聚糖，缓慢加热直至壳聚糖完全溶解，静置冷却后备用。

1.3.3 各指标测定方法

1）透光率：取离心后的澄清果酒汁，以蒸馏水作为对照，在800 nm处测定透光率[3]。

式中：A为吸光度。

2）总酸：采用酸碱滴定法[4]。总糖：采用直接滴定法[4]。酒精度：酒精计法[4]。干浸出物：比重瓶法[4]。总酚：Folin-Denis法。蛋白质：考马斯亮蓝G-250法。

1.3.4 稳定性试验

1）蛋白质稳定性试验：取100 mL澄清酒液，向其加入2 mL 10 g/L单宁液，在80℃水浴加热30 min左右，静置冷却，若发现絮状沉淀，则说明含有过量蛋白，使瓶内蛋白败坏。

2）氧化稳定性试验：取100 mL澄清酒液在室温下放置24 h，若颜色、气味等发生变化则说明其氧化性不稳定。

3）铁稳定性试验：取100 mL澄清酒液进行开瓶通气处理，然后塞住瓶口不断摇动将酒瓶倒置，7 d后观察是否有沉淀，若有沉淀，则表明铁败坏。

4）铜稳定性试验：取100 mL澄清酒液密封后平放接受阳光照射，7 d后观察是否有浑浊，若有浑浊，则表明铜败坏。

5）生物稳定性试验：取100 mL澄清酒液密封后在30℃恒温箱里培养10 d，观察与原酒感官差别，若差别很大则说明引起生物污染。

6）将不同澄清剂处理后的红树莓果酒，分别进行冷处理（-4℃静置1 d）和热处理（90℃水浴加热10 min），观察酒体变化[5-6]。

1.3.5 复合澄清剂澄清效果试验

经预试验得出壳聚糖和皂土的澄清效果优于明胶，因此选择壳聚糖（2%）和皂土（2%）不同质量比例混合作为复合澄清剂，且复合澄清剂与原酒比例为2.5 g/L。以透光率为指标，分别对复合澄清剂质量比（1∶1、1.5∶1、2 ∶1、2.5∶1、3∶1、3.5∶1）、水浴温度（30、35、40、45、50、55 ℃）和水浴时间（10、20、30、40、50、60 min）3个因素进行单因素试验，在室温下静置72 h后，3 000 r/min离心15 min，取上清液在800 nm处测定其透光率。

1.3.6 复合澄清剂澄清条件响应面优化试验

根据单因素试验的结果，采用Box-Benhnken法对复合澄清剂比例、水浴温度及水浴进行三因素三水平优化试验设计，相应的因素水平见表1，数据处理采用Design Expert 7.5软件。

表1 Box-Benhnken法响应面因素水平表Table 1 Factor level table used in the Box-Behnken design

2 结果与分析

2.1 复合澄清剂澄清单因素试验

2.1.1 复合澄清剂比例对红树莓果酒的澄清效果

复合澄清剂比例对红树莓果酒澄清效果的影响见图1。

由图1可知，壳聚糖和皂土复合使用对红树莓果酒澄清效果显著，平均透光率达到85%以上。随着壳聚糖与皂土比例增加，透光率明显上升，当质量比达到2.5∶1时透光率达到最高87.5%。当比例继续增大后，透光率呈现急速下降趋势。澄清后试管底部出现大量沉淀，酒体澄清透明无悬浮物。皂土吸水膨胀后形成了带负电荷的胶体悬浮液，能够与带正电荷的蛋白质等浑浊物相互吸附形成絮状沉淀[7-10]；壳聚糖溶于稀酸溶液中，形成带正电荷的分子，与树莓果酒中带负电荷的颗粒相互作用，使果酒中果胶等沉淀下来[11-12]。壳聚糖与皂土联合作用吸附酒液中正负电荷浑浊物，澄清效果优于单一澄清剂。当澄清剂比例增大时，浑浊物已被完全沉淀，过量的壳聚糖形成的胶体系统阻碍了酒体澄清。

图1 复合澄清剂比例对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.1 Effect of compound clarifying agents’ratio on clarifying of red raspberry wine

2.1.2 水浴温度对红树莓果酒的澄清效果

水浴温度对红树莓果酒澄清效果的影响见图2。

图2 水浴温度对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.2 Effect of bath temperature on clarification of red raspberry wine

由图2可知，水浴温度在30℃~45℃之间，透光率会随着水浴温度升高而上升，当温度达到45℃时，红树莓果酒澄清效果较好，透光率达到87.3%，继续升温，透光率稍有下降，但变化很小。在一定水浴温度范围内可以使红树莓中蛋白质、胶体物质凝结沉淀，而且利于皂土吸水膨胀，与壳聚糖充分结合，分子之间相互作用形成氢键和共价键，吸附红树莓果酒中的带正负电荷的杂质，增强了复合澄清效果[5]，但水浴温度继续升高影响红树莓果酒中的有效成分例如花色苷、鞣花酸等的活性，酒体分解部分物质影响澄清度。

2.1.3 水浴时间对红树莓果酒的澄清效果

水浴时间对红树莓果酒的澄清效果见图3。

图3 水浴时间对红树莓果酒澄清效果的影响Fig.3 Effect of bath time on clarification of red raspberry wine

由图3可知，随着水浴时间的延长，透光率迅速上升，当水浴时间达到30 min时，透光率达到87.4%，继续延长水浴时间，透光率明显下降后趋于平稳。因为适当的水浴时间利于酒液中正负电荷微粒之间相互作用，复合澄清剂与其絮凝沉淀，若水浴时间太长会造成复合澄清剂粘度过大，不利于澄清且影响果酒品质。

2.2 响应面优化实验结果分析

根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，以果酒透光率作为响应值（R1），在单因素的基础上选取复合澄清剂比例（A）、水浴温度（B）、水浴时间（C）为考察因素，并以-1，0，1代表每组3个水平设计三因素三水平的响应面优化试验见表2。

表2 响应面优化试验设计及结果Table 2 Design and results of response surface methodology test

续表2 响应面优化试验设计及结果Continue table 2 Design and results of response surface methodology test

使用Design Expert 7.5软件对表2中数据进行非线性回归的二次多项式拟合，得到预测模型方程如式（2）。

表3为回归方程方差分析结果，显著性检验表明该回归模型显著（p＜0.000 1），失拟项不显著，且该模型的R2=0.979 5，R2adj=0.953 2，说明该模型与实际拟合较好，自变量与响应值之间线性关系显著，可以预测复合澄清剂澄清红树莓果酒工艺。

表3 方差分析结果Table 3 Analysis of variance（ANOVA）of the regression model

各因素的F值可以反映各因素对试验指标的重要性，F值越大，表明对响应值的影响越大。如表3所示，FA=22.99，FB=6.98，FC=61.69，故可知各因素对红树莓果酒透光率的影响主次顺序为：水浴时间＞复合澄清剂比例＞水浴温度。由表3还可以看出，方程的一次项A（复合澄清剂质量比）和C（水浴时间）对响应值的影响极显著，B（水浴温度）对响应值的影响显著，二次项 A2、B2、C2对响应值的影响均为极显著，A、B、C 之间交互作用对响应值的影响不显著（图4）。

图4 复合澄清剂比例、水浴温度和水浴时间对红树莓果酒透光率交互影响的响应面和等高线图Fig.4 Response surface plots and contour lines of the interactive effect among the compound clarifying agents’ratio，bath temperature and bath time on clarification of red raspberry wine

由该模型优化得到复合澄清剂澄清红树莓果酒的最优工艺为：复合澄清剂（壳聚糖：皂土）质量比为2.62∶1，水浴时间33.59 min，水浴温度45.38℃，果酒透光率为91.32%。考虑实际操作，设定复合澄清剂质量比3∶1，水浴时间35 min，水浴温度45℃，按上述条件进行3组平行验证试验，平均透光率为91.26%，与理论预测值相近，故通过该响应面优化后得出的回归方程具有实际意义。

2.3 不同澄清剂对红树莓果酒澄清效果及品质影响

澄清剂对红树莓果酒澄清效果及各成分变化见表4。

表4 澄清剂对红树莓果酒澄清效果及各成分变化Table 4 The clarifier effects on the clarification of red raspberry wine and the change of each component

由表4可知，红树莓果酒经澄清剂处理后，其总糖、总酸、酒精度的含量与澄清前相比，变化不太明显。各个澄清剂均降低了总酚的含量，明胶主要吸附红树莓果酒中单宁物质，使总酚含量下降显著；澄清后果酒的干浸出物均比原酒低，壳聚糖对干浸出物影响最大；澄清剂都使红树莓果酒中蛋白质含量减少，其中皂土处理的果酒蛋白质下降最多，因为皂土主要吸附蛋白质等浑浊物质；复合澄清剂对红树莓果酒澄清效果优于单一澄清剂，透光率从59.3%上升到91.26%。综合考虑澄清剂对红树莓果酒的透光率、品质等影响，试验认为，壳聚糖-皂土复合澄清剂可以达到澄清的效果，且对果酒的质量影响不大。

2.4 不同澄清剂对红树莓果酒稳定性影响

澄清剂对红树莓果酒稳定性的影响见表5。

表5 澄清剂对红树莓果酒稳定性的影响Table 5 The clarifier effects of stability on the clarification of red raspberry wine

由表5可知，原酒本身不稳定，容易氧化、染菌等，经过冷处理会使红树莓果酒中酒石酸盐沉淀，而热处理会引起果酒中蛋白质、单宁、果胶等颗粒被絮凝沉淀下来。单一添加明胶、皂土、壳聚糖作为澄清剂使酒体达到基本的稳定，皂土可以吸附铁离子，所以铁稳定性很高[12-13]，而明胶吸附红树莓果酒中的单宁类物质，壳聚糖吸附酒液中负电荷微粒，总体使果酒中蛋白质稳定性提高，而冷热处理均出现少量沉淀，这是由发酵中残留的蛋白质、果胶等物质引起的。选用复合澄清剂稳定性明显提高，而冷处理时有少量沉淀，是因为红树莓果酒中酒石酸盐比较多，低温使其沉淀。

3 结论

目前，选取复合澄清剂并运用响应面分析法研究红树莓果酒澄清工艺很少报道。本文研究结果表明采用复合澄清剂可以达到理想的澄清效果，且对红树莓果酒总糖、总酸及酒精度的保存率较好，酒液更加清亮透明，色泽深红，苦涩味减少。经试验确定影响果酒透光率的主要因素为水浴时间，其次是复合澄清剂比例、水浴温度，采用复合澄清剂质量比3∶1，在45℃水浴中加热35 min，其透光率为91.26%，澄清效果显著。通过澄清工艺，减轻了红树莓果酒后续过滤的难度，对今后工业化生产有一定的指导意义。

[1] 籍艳秋.覆盆子的补肾活性成分研究[J].中国卫生标准管理,2015,6(19):125-126

[2] 司旭,陈芹芹,毕金峰,等.树莓主要功能性成分研究进展[J].食品工业科技,2015,36(4):376-381

[3] 师艳秋,李亚东,辛秀兰,等.红树莓发酵酒澄清的研究[J].中国酿造,2009,202(1):122-124,130

[4] 农业部.GB/T 15038-2006葡萄酒,果酒通用分析方法[S].北京:中华人民共和国国家标准部,2006

[5] 王芳,邓启,段伟丽,等.响应面法优化复合澄清剂对蓝莓果酒的澄清效果[J].中国食品学报,2016,16(8):149-158

[6] 冉娜,徐彬,雷湘兰,等.不同澄清剂在龙眼果酒中的澄清效果及稳定性研究[J].食品工业科技,2016,37(2):287-290,295

[7] 严红光,姚平伟,郭红莉,等.不同澄清剂对青梅果酒澄清效果的影响[J].凯里学院学报,2016,34(6):60-63

[8] 邵晓庆,贠建民,艾对元,等.不同澄清剂对野草莓果酒澄清效果的比较[J].甘肃农业大学学报,2015,50(4):121-127,134

[9] 董瑞丽,明红梅,郭志,等.猕猴桃果酒澄清剂的选择与处理条件优化[J].江苏农业科学,2015,43(7):300-303

[10]武璐婷,蒋和体.半干型酥梨果酒发酵和澄清工艺比较研究[J].中国酿造,2015,34(5):135-137

[11]梁红云,王英,刘小莉,等.几种澄清剂对黑莓果酒中蛋白质的影响[J].中国酿造,2015,34(03):126-129

[12]姜燕,尤婷婷,柳佳齐,等.壳聚糖絮凝作用在中药和果酒澄清中的应用[J].食品工业,2015,36(2):228-231

[13]于翔,单春会,程卫东.基于响应面分析不同澄清剂对沙枣果酒澄清效果的影响[J].中国酿造,2016,35(6):150-154

Effect of Compound Clarifying Agents on the Clarification of Red Raspberry Wine

YU Run-mei，JIANG Yan*，ZHANG Hai-yue，ZHAI Shuo
（College of Chemical and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

The study aimed to discuss the optimum technology conditions for the clarification of red raspberry wine with the chitosan and bentonite as the compound clarifying agents and its stability.With the light transmittance rate of red raspberry wine as the response value，the effects of the ratio of compound clarifying agents，the temperature of water bath and the time of water bath on the clarification of red raspberry wine were studied by means of Box-Behnken center combination test and response surface methodology.The results showed that the optimum parameters of the compound clarifying agents of red raspberry wine，and the formula was as follows：compound clarifying agents'ratio 3∶1，bath temperature 45℃，bath time 35 min.The light transmittance rate was 91.26%and the response surface fitted good predictive value of 91.32%.The clarified wine was luminous red and transparent clear and had the features of rich nutrition，pure taste and good stability.

red raspberry；fruit wine；chitosan；bentonite；clarification

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.026

于润美（1991—），女（汉），硕士研究生，研究方向：天然产物提取及功能食品研究。

*通信作者

2017-04-06