“凤丹”牡丹果皮多糖提取研究

陈刚，马晓，郝苗青，赵奇

（1.郑州师范学院，河南郑州450044；2.河南职业技术学院，河南郑州450046）

“凤丹”牡丹果皮多糖提取研究

陈刚1，马晓2，郝苗青1，赵奇1

（1.郑州师范学院，河南郑州450044；2.河南职业技术学院，河南郑州450046）

以水酶法提取"凤丹"牡丹果皮多糖，以提取温度、提取液pH值、纤维素酶用量、提取时间为考察因素，以多糖得率为评价指标，采用正交试验优选工艺。正交试验结果表明多糖提取的最优提取条件组合为提取温度55℃、提取液pH 4.5、纤维素酶用量0.8%、提取时间80 min时，牡丹果皮多糖得率达到最大，为（34.196±0.379）mg/g。

"凤丹"牡丹果皮；多糖；提取工艺；正交试验

牡丹籽油在2011年被认定为新资源食品，“凤丹”牡丹（Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’）是榨取牡丹籽油常用的品种之一，随着牡丹籽油的急性肝损伤保护[1]、抗糖尿病[2]、降血脂[3]、降血糖[4]、防晒[5]等保健功能[6-8]逐渐被人们重视，其种植面积将逐年扩大，其副产物——果皮也将大量产生，为果皮资源的再利用提供技术支持是非常迫切的。牡丹叶片[9]、根皮[10]、种仁[11]等部位的多糖提取工艺均有研究，而牡丹果皮多糖提取工艺却未见报道，本文拟对“凤丹”牡丹果皮提取工艺进行初步研究，以期对牡丹果皮资源开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

“凤丹”牡丹果皮：将2016年8月采收的五年生实生苗“凤丹”牡丹果皮置于室内阴干，9月于鼓风干燥箱60℃烘干后用旋风磨制粉，过100目筛，干粉贮于棕色瓶内备用。

葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖：sigma公司；浓硫酸、浓盐酸：河南东科化工产品销售有限公司；蒽酮：天津市科密欧化学试剂有限公司；以上试剂均为分析纯；纤维素酶（酶活力为400 U/mg）：南京都莱生物技术有限公司。

DHG-9140型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；T6型紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；JA3003N型电子天平：上海菁海仪器有限公司；HH-S4型数显恒温水浴锅：金坛市医疗仪器厂；FOSS SCINO CT410旋风磨：杭州嘉维创新科技有限公司；MINI型超纯水机：湖南科尔顿水务有限公司。

1.2 方法

1.2.1 混标糖标准曲线的制作

混标糖标准曲线的制作参考王婉冰[12]的方法，有改进。用天平称取50 mg的混糖（葡萄糖、半乳糖、木糖、果糖、蔗糖，每种各10 mg）放入烧杯，加蒸馏水，搅拌，待溶解后定容至100 mL。用移液枪量取混和溶液于7支试管中，在试管上分别编号1至7号，7只试管分别量取含 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 g 混标糖体积的混合液，向7只试管中加入蒸馏水，使每支试管的溶液体积均达到1.0 mL，蒽酮硫酸比色法[13]测吸光度，拟合线性回归方程。

1.2.2 牡丹果皮多糖的提取

牡丹果皮多糖提取试验于烧杯中加入0.4 g“凤丹”牡丹果皮干粉，加入10 mL相应pH值的盐酸缓冲液振荡均匀后再加入不同用量的纤维素酶，摇匀后置于相应温度的水浴锅中提取相应时长，自然冷却后转移至100 mL容量瓶并用相应pH值的盐酸缓冲液定容，4 000 r/min离心5 min后，取上清液备用。

1.2.2.1 单因素试验

在提取液pH4、纤维素酶用量为0.5%、提取70min的条件下，考察提取温度为 45、50、55、60、65、70 ℃时对多糖得率的影响。

在提取温度50℃、纤维素酶用量为0.5%、提取70 min的条件下，考察提取液 pH 为 3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5时对多糖得率的影响。

在提取温度50℃、提取液pH 4、提取70 min的条件下，考察纤维素酶用量分别为果皮质量的0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%时对多糖得率的影响。

在提取温度50℃、提取液pH 4、纤维素酶用量为0.5%的条件下，考察提取时间为 50、60、70、80、90、100 min时对多糖得率的影响。

1.2.2.2 正交试验

在单因素试验基础上，采用L9（34）正交试验，对提取温度、提取液pH值、纤维素酶用量和提取时间等4个因素的条件进行优化，方案设计如表1所示。

表1 正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.2.3 多糖得率的测定

准确吸取“凤丹”牡丹果皮干粉提取液1 mL，用蒽酮-硫酸比色法测吸光度，将结果代入制作好的混标糖标准曲线方程内，根据公式计算结果。多糖得率计算公式如下：

式中：C为根据测定吸光度和标准曲线方程计算出样品中多糖浓度，mg/mL；V为提取上清液体积，mL；N为稀释倍数；m为果皮质量，g。

1.3 数据处理方法

试验数据用SPSS13.0进行统计分析，采用邓肯氏新复极差测验法检验，以p＜0.05为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 混标糖标准曲线

混标糖标准曲线见图1。

图1 混标糖标准曲线Fig.1 Standard curve of sugar mixture

根据不同质量分数的混标糖标准溶液以及其对应的吸光度，拟合线性方程为y=0.822 4x+0.014 8，R2=0.993 5，式中：y为吸光度值；x为混标糖含量。

2.2 单因素试验

2.2.1 提取温度对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响

提取温度对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响见图2。

图2 提取温度对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响Fig.2 Effect of extaction temperature on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由图2可知，提取温度对多糖的得率影响较大。45℃到55℃范围内，多糖得率随着提取温度的增加而增加，提取温度为55℃时多糖得率为23.494 mg/g，达到最大值，这可能是由于提取温度的升高，促进了多糖在反应溶液中的溶出，提高了多糖得率；但当提取温度为55℃到70℃范围内时，多糖得率反而逐渐降低，这可能是由于提取温度过高，导致多糖在高温环境中有部分被破坏。方差分析结果表明，提取温度为55℃时的多糖得率显著（p＜0.05）大于其他几个处理水平的多糖得率。因此，选取50、55、60℃3个水平用于正交试验设计。

2.2.2 提取液pH值对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响

提取液pH值对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响见图3。

图3 pH值对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响Fig.3 Effect of pH on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由图3可知，pH4.5时，多糖得率最大，为23.465 mg/g，这是因为酶分子活性部位基团受pH值影响。在最适pH值时，底物最适与酶分子上活性基团结合。pH值高于或低于最适pH值时，活性基团的解离状态将发生改变，酶和底物的亲和力降低，表现为酶促反应速度降低。因此，选用pH 4.0、4.5、5.0进行正交试验设计。

2.2.3 纤维素酶用量对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响

纤维素酶用量对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响见图4。

图4 纤维酶素用量对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响Fig.4 Effect of cellulase content on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由图4可知，随着纤维素酶用量的增加，多糖得率是逐渐上升的。在0.4%到0.7%的区间内多糖得率增加最快，可能是由于添加了纤维素酶后有利于果皮中纤维素的降解，促进了果皮中多糖的溶出，提高了多糖得率；当纤维素酶用量为0.7%到0.9%时，多糖得率增加速度缓慢，这可能是由于纤维素酶添加量过高，纤维素酶水解纤维素的功能不能得到充足的表现，对多糖溶出的促进作用表现不明显。方差分析结果表明，0.7%、0.8%和0.9%3个处理水平之间没有显著性（p＞0.05）差异。故选取0.6%、0.7%和0.80%3个水平用于正交试验设计。

2.2.4 提取时间对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响

提取时间对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响见图5。

图5 提取时间对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响Fig.5 Effect of extaction time on the yield of polysacchandes from Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp

由图5可以看出，不同的提取时间对多糖得率的影响是不同的。提取时间在50 min到80 min范围内时，多糖的得率是逐渐上升的，可能是由于提取时间的延长，有较多的多糖溶解到溶液中；提取时间为80、90、100 min 时，多糖的得率分别为 23.860、24.322、24.466 mg/g，且此3个水平之间没有显著性差异（p＞0.05），这可能由于多糖在较高的温度条件下保持时间较长而被破坏，抵消了由于提取时间的延长而对多糖得率增加的缘故。通过单因素试验选取70、80、90 min 3个处理水平用于正交试验设计。

2.3 正交试验

正交试验结果见表2。

表2 L9（34）正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test L9（34）

续表2 L9（34）正交试验结果Continue table 2 Results of orthogonal test L9（34）

由表2可知，影响“凤丹”牡丹果皮干粉多糖得率的主次顺序为提取温度影响最大，其次是提取液pH值，再次是提取时间，最后是纤维素酶用量。

正交试验方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 The results of ANOVA

由表3可知，提取温度、提取液pH值、提取时间3个试验因素均达到显著（p＜0.05）水平，表明试验中的提取温度、提取液pH值、提取时间均显著（p＜0.05）地影响多糖的得率。而纤维素酶用量对多糖得率的影响未达到显著性（p＞0.05）水平。

2.4 验证试验

经极差分析可知，当组合为A2B2C3D2，即提取温度55℃、提取液pH 4.5、纤维素酶用量0.8%、提取时间80 min时，“凤丹”牡丹果皮多糖得率将达到最大。由于此组合未出现在上述正交试验组合中，故按此工艺条件进行验证试验，得出最优组合提取条件下的多糖得率为（34.196±0.379）mg/g，高于正交试验中任一提取工艺组合的多糖得率。

3 讨论

本研究采用水酶法从“凤丹”牡丹果皮中提取多糖，考察了提取温度、提取液pH值、纤维素酶用量、提取时间4个因素对“凤丹”牡丹果皮多糖得率的影响。在单因素试验的基础上，进行正交试验，得出“凤丹”牡丹果皮多糖提取的最优条件为提取温度55℃、提取液pH 4.5、纤维素酶用量0.8%、提取时间80 min，按此提取工艺，多糖的得率为（34.196±0.379）mg/g，大大提高了多糖得率，节约了能源，提高了效率，本试验可以为“凤丹”牡丹果皮资源开发提供依据，为“凤丹”牡丹果皮的再利用提供理论支持。

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Extraction of Polysaccharide in Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’Pericarp

CHEN Gang1，MA Xiao2，HAO Miao-qing1，ZHAO Qi1
（1.Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，Henan ，China；2.Henan Polytechnic College，Zhengzhou 450046，Henan，China）

The aqueous enzymatic extraction of polysaccharides of peony （Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’）pericarp was studied.The extraction temperature，pH of extraction solution，cellulose amount，extraction time on the extraction yield of polysaccharides was assessed with an orthogonal test to confirm the optimal extractive parameters.The orthogonal test results showed that the optimal process combination was extraction temperature 55℃，pH 4.5 of extraction solution，cellulose amount 0.8%，extraction time 80 min with the maximum yield of polysaccharides of（34.196±0.379）mg/g.

Paeonia suffruticosa‘Feng Dan’pericarp；polysaccharide；extraction technology；orthogonal test

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.009

河南省科技攻关项目（172102110219）；郑州市科技计划项目（153PKJGG148）；河南省高等学校重点科研项目（16B550008）

陈刚（1979—），男（汉），讲师，硕士研究生，主要从事生物活性物质提取及功能研究工作。

2017-03-30