柠檬苦素的抗氧化与抑菌效果研究

章斌，侯小桢，邓其海，丁心，陈晓芸，秦轶，张海鑫

（1.韩山师范学院食品工程与生物科技学院，广东潮州521041；2.广东中兴绿丰发展有限公司，广东河源517000）

柠檬苦素的抗氧化与抑菌效果研究

章斌1，侯小桢1，邓其海2，丁心2，陈晓芸1，秦轶2，张海鑫1

（1.韩山师范学院食品工程与生物科技学院，广东潮州521041；2.广东中兴绿丰发展有限公司，广东河源517000）

采用有机溶剂法提取尤力克柠檬果皮和果籽中的柠檬苦素并测定其含量，并对其抗氧化与抑菌活性进行研究。试验结果表明：柠檬籽较柠檬皮含更多苦素类化合物，且籽提取液中所含柠檬苦素的浓度为2.766 4×10-1mg/mL；柠檬皮提苦素物和柠檬籽提苦素物对DPPH自由基的清除作用不明显，试验条件下的抑制率最高仅为14.58%，远低于同浓度特丁基对苯二酚（tert-Butylhydroquinone，TBHQ）；2 mg/mL用量的提取液对猪油贮藏期有一定延缓效果。抑菌活性试验结果表明从柠檬皮和柠檬籽中提取的苦素物质对大肠杆菌、根霉、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌均有一定的抑菌作用，两者均对枯草芽胞杆菌的抑菌效果最好，且皮提苦素物和籽提苦素物对枯草芽胞杆菌的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）和最小杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）分别均为0.5 mg/mL和0.75 mg/mL。

柠檬；柠檬苦素；抗氧化；抑菌

柠檬苦素是广泛存在于柠檬等柑橘属水果皮和籽中的一类功能性化合物，具有抗肿瘤[1]、抗病毒[2]、抑菌[3]、镇痛抗炎[4]等多种生物活性，是生产药物、功能性食品的主要原料或配料成分之一。

广东是我国尤力克柠檬的主产地之一，伴随柠檬加工而大量产生的皮籽等副产物，对其进行柠檬苦素、精油等功效成分开发是高值化综合利用的有效途径之一。因此，本试验以尤力克柠檬为试材，提取果皮和果籽中的苦素类化合物，并探讨其抗氧化与抑菌效果，旨在为柠檬苦素的应用及柠檬加工副产物的综合利用提供一定试验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

柠檬：广东中兴绿丰发展有限公司顺天镇柠檬种植基地；枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、根霉、黑曲霉：韩山师范学院微生物实验室。DPPH：Sigma公司；丙酮、石油醚、抗坏血酸、焦性没食子酸、牛肉膏、蛋白胨、氢氧化钠、盐酸、碘化钾、乙酸，硫代硫酸钠、异辛烷、柠檬苦素标准品等（均为分析纯）：上海金穗生物科技有限公司。生育酚（Tocopherol，VE）：食品级。

HWS-24型电热恒温水浴锅、LRH-250型生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；DHG-9123A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司；AUW120型电子分析天平：日本岛津公司；LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；高效液相色谱仪1200系列：安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 柠檬苦素提取[5-6]

取柠檬皮和柠檬籽于45℃烘干后粉碎并过80目筛，用索氏抽提法去脂质；然后将去脂质后的柠檬皮粉末和柠檬籽粉末用丙酮浸泡24 h后，70℃条件下水浴回流提取2 h。

1.2.2 柠檬苦素含量的测定[7-8]

配制 2.00、1.00、0.50、0.25、0.125、0.012 5 mg/mL的柠檬苦素标准液备用；并将柠檬皮粗提物溶液与柠檬籽粗提物溶液用针孔式滤膜进行过滤备用。色谱条件：流动相为乙腈-水（体积比为 45∶55），流速 1.00 mL/min，柱温25℃，检验波长210 nm，进样量10 μL。

1.3 抗氧化活性试验

1.3.1 DPPH自由基清除率的测定[9]

用 95%乙醇配制 0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的柠檬皮粗提物溶液、柠檬籽粗提物溶液、柠檬苦素标准品溶液、TBHQ溶液、VC溶液各15 mL为样品液；精确吸取上述各浓度溶液2 mL，分别加入2 mL 0.1mmol/L的DPPH溶液，摇匀并放置30min，于517nm处测定吸光度A；同时测定2 mL上述溶液与2 mL 95%乙醇混合液的吸光度A0，及2 mL DPPH溶液与2 mL 95%乙醇混合液的吸光度A1，按下式计算清除率：

1.3.2 膜脂质（猪油）抗氧化试验

取2 mg/mL的柠檬皮粗提物溶液、柠檬籽粗提物溶液、焦性没食子酸液和VE液各5 mL于50.00 g猪油中，搅拌均匀，置于60℃电热恒温烘箱，每4小时定时搅拌，并做空白试验，每隔2天取样测定过氧化值（Peroxide value，POV）；测定和计算方法按GB 5009.227-2016《食品安全国家标准食品中过氧化值测定》的规定进行。

1.4 抑菌活性试验

1.4.1 抑菌圈的测定[10-11]

取直径6 mm灭菌后的滤纸片，分别放入柠檬皮抽提液、柠檬籽抽提液（2 mg/mL）中浸泡12 h；吸取0.1 mL浓度为106cfu/mL的悬菌液，均匀涂布于已制备好的培养基中；然后将滤纸片贴在含菌的平板培养基上，每皿4片，置于恒温培养箱中培养24 h后观察。同时用丙酮做空白试验，测定抑菌圈直径。

1.4.2 最低抑菌浓度（MIC）的测定[3]

用丙酮配制 2.00、1.75、1.5、1.25、1.00、0.75、0.50 mg/mL的柠檬苦素粗提物溶液，并各取2.0 mL加入到培养基中混匀凝固，然后对各供试菌进行平板划线，按各菌种相应的适宜生长温度条件培养观察，以完全不长菌的最低提取物浓度为该提取物的最低抑菌浓度。

1.4.3 最小杀菌浓度（MBC）的测定

取柠檬苦素抽提液浓度大于等于MIC的培养皿，继续在相应温度条件下培养24 h后观察菌落生长情况，以不长菌的最低抽提液浓度为最小杀菌浓度（MBC）。

1.5 数据处理

试验结果以平均值±标准偏差SD表示，用SAS 8.1统计软件进行一维方差分析。

2 结果与分析

2.1 柠檬苦素含量测定

柠檬苦素标准品、柠檬皮抽提液和柠檬籽抽提液的色谱检测图分别如图1、图2和图3所示。

图1 柠檬苦素标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of limonin standard substance

图2 柠檬皮提取物的液相色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of lemon peel extract

图3 柠檬籽提取物的液相色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of lemon seed extract

对照图1出峰时间，图2和图3中在同样的保留时间7.920 min时均各出现一个峰面积，说明柠檬皮抽提液和柠檬籽抽提液中均含柠檬苦素；运用外标法测得柠檬皮抽提液和柠檬籽抽提液中的柠檬苦素浓度分别为 1.832 6×10-1mg/mL 和 2.766 4×10-1mg/mL。

2.2 柠檬苦素的抗氧化活性

2.2.1 膜脂质（猪油）抗氧化作用

猪油在不同抗氧化剂作用下的POV值见图4。

图4表明，添加有抗氧化剂和柠檬苦素抽提液的猪油的POV值上升相对较慢，且柠檬皮提物和籽提物的猪油脂质抗氧化活性介于VE和焦性没食子酸之间。另外，VE因其良好的油溶性、热稳定性和氧稳定性，使得试验期间的猪油POV值增幅不大；而柠檬苦素对光和热较敏感，易发生多酚结构和取代基团改变后的抗氧化能力下降[12-13]，因而添加柠檬皮提物和籽提物的猪油POV值在第10天后开始大幅度上升。

图4 猪油在不同抗氧化剂作用下的POV值Fig.4 POV of lard under different antioxidants

2.2.2 对DPPH自由基的抑制作用

柠檬苦素粗提物和TBHQ清除DPPH自由基能力见图5。

图5 柠檬苦素粗提物和TBHQ清除DPPH自由基能力Fig.5 Ability of limonin and TBHQ scavenging DPPH free radical

从图5可看出，TBHQ对DPPH自由基的抑制作用随浓度增大的变化不大，稳定在52%～62%之间；柠檬皮提物和籽提物的DPPH自由基抑制率尽管有随浓度增大而相应增强的趋势，但总体抑制作用不明显，在试验浓度范围内，皮提苦素物和籽提苦素物的DPPH自由基抑制率最高仅为14.58%和6.48%，且皮提苦素物较籽提苦素物表现出更好的DPPH自由基抑制效果。

另一方面，尽管测得柠檬籽中的苦素类化合物含量高于皮提物，但柠檬皮提物中可能含有的精油、黄酮等化合物同样具有较强的抗氧化活性，因而柠檬皮提物的总体抗氧化活性高于籽提物；图4和图5的曲线走向较直观地说明了这一点。同时，Jun Y[14]对提取于柑橘中的柠檬苦素的DPPH自由基抑制作用结果表明其清除率仅为0.5%；Breksa[15]的研究结果同样表明0.001 mg/mL～1.0 mg/mL浓度的柠檬苦素类化合物清除DPPH自由基的效果不显著。而本试验中的柠檬皮提苦素物和籽提苦素物的DPPH自由基抑制效果较他们的试验结果显著，也可能是与提取物中含有少量的酚类、黄酮类等化合物有关。

2.3 柠檬苦素的抑菌活性

研究表明：柠檬苦素化合物受其原料来源、原料部位、化学结构构成和含量浓度等多因素影响，对不同微生物的抑菌效果差别较大：如从枸橘中提取分离的柠檬苦素对单增李斯特菌有较佳的抑制作用，且其最小抑菌浓度介于 15.62 μg/mL～62.5 μg/mL[16]。从柑橘籽中提取的柠檬苦素在1.0 g/L条件下对地衣芽孢杆菌和枯草芽抱杆菌的抑制效果较好，而对大肠杆菌、毛霉、金黄色葡萄球菌、黑曲霉几乎没有抑制作用[17]；降解性柠檬苦素类化合物梣酮、9-β-羟基梣酮均对黄瓜黑星菌的生长具有抑制作用[17]。

柠檬皮提苦素的抑菌效果见表1，柠檬籽提苦素的抑菌效果见表2。

表1 柠檬皮提苦素的抑菌效果Table 1 Antimicrobial effects of limonin from lemon peel

表2 柠檬籽提苦素的抑菌效果Table 2 Antimicrobial effects of limonin from lemon seed

从表1和表2的抑菌圈直径测定结果来看，柠檬苦素提取物对大肠杆菌、根霉、枯草芽胞杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑制效果，与罗水忠[6]从柑橘籽中所提柠檬苦素对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉的抑制作用研究结果有一定差别。综合MIC和MBC测定结果，柠檬皮中苦素粗提物抑制作用的强弱次序为枯草芽胞杆菌＞大肠杆菌＞根霉＞黑曲霉＞金黄色葡萄球菌；柠檬籽中苦素粗提物抑制作用的强弱次序为枯草芽胞杆菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠杆菌＞根霉＞黑曲霉。

柠檬苦素类化合物中的呋喃环已被证明是其抗菌的必要功能基团[18]，但也可能还存在其它具有较好抑菌功效的基团；因此，柠檬苦素化合物对微生物的抑菌效果及具体的抗菌机理有待继续深入研究。

3 结论

1）经有机溶剂法萃取所得的柠檬皮提物和柠檬籽提物中分别含有1.832 6×10-1mg/mL和2.766 4×10-1mg/mL的柠檬苦素类化合物。

2）提取于柠檬皮和柠檬籽中的苦素类化合物对DPPH自由基的清除作用不明显，远低于TBHQ；但在2 mg/mL用量下对猪油贮藏期有一定延缓效果。

3）柠檬苦素化合物对几种代表性细菌和真菌有一定的抗菌活性，其中柠檬皮提苦素物对枯草芽胞杆菌的抑制效果最强，对金黄色葡萄球菌的抑制效果最差；而柠檬籽提苦素物对枯草芽胞杆菌的抑制效果最强，而对黑曲霉的抑制效果最差。

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Study on Antioxidant and Antibacterial Activities of Limonins

ZHANG Bin1，HOU Xiao-zhen1，DENG Qi-hai2，DING Xin2，CHEN Xiao-yun1，QIN Yi2，ZHANG Hai-xin1
（1.School of Food Engineering and Biotechnology，Hanshan Normal College，Chaozhou 521041，Guangdong，China；2.Guangdong Zhongxing Lvfeng Development Co.，Ltd.，Heyuan 517000，Guangdong，China）

Limonins from Eureka lemon peel and lemon seed was extracted by organic solvent method and its content was determined，meanwhile，antioxidant and antibacterial activities of limonins in vitro were explored in this paper.Results showed that lemon seeds contain more limonins than lemon peel，the concentratin of the citrate contained in lemon seeds reached 2.766 4×10-1mg/mL；limonoids from lemon peel and seeds had no significant scavenging effects on DPPH free radical，the highest clearance rate under experimental conditions reached only 14.58%，far lower than that of the same concentration of TBHQ.Meanwhile，limonins extracted from lemon peel and lemon seeds had a certain delaying effect on storage period of lard under dosage of 2 mg/mL.Antibacterial activity test results indicated that Limonins extracted from lemon peel and lemon seed exhibited certain antibacterial effects onEscherichia coli，Rhizopus，Bacillus subtilisandStaphylococcus aureusand both showed a best efficiency for Bacillus subtilis with MIC and MBC were 0.5 mg/mL and 0.75 mg/mL respectively.

lemon；limonins；antioxidant activity；antibacterial activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.22.001

国家星火计划项目（2015GA780044）；广东省"扬帆计划"引进创新创业团队专项资助（2015YT02H049）；广东省科技计划项目（2012A020603008）；广东省教育部产学研结合项目（2012B091000074）；广东普通高校工程技术开发中心项目“粤东食品加工与安全控制工程技术开发中心”（GCZX-A1415）；潮州市重点农业科技项目（201605）

章斌（1981—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：农产品加工与质量安全。

2017-08-04