闽产三叶青地上部分抗炎提取物的急性毒性研究

陈 红， 廖淑彬， 陈 丹， 谢 平， 黄 娇

闽产三叶青地上部分抗炎提取物的急性毒性研究

陈 红1， 廖淑彬2， 陈 丹2， 谢 平2， 黄 娇2

目的观察闽产三叶青地上部分抗炎提取物的小鼠急性毒性反应，初步评价其用药安全性。方法取昆明小鼠60 只，雌雄各半，按体质量随机分为各给药组及空白组；给药组按0.3 mL/10 g最大给药体积，以0.75 g/mL闽产三叶青地上部分抗炎提取物(THAA)的最大浓度药液、0.67 g/mL闽产三叶青粗提物(粗提物)的最大浓度药液分组给药；空白组灌服0.3 mL/10 g蒸馏水。24 h内灌胃给药 3 次，间隔8 h，一次性口服灌胃给药，连续观察14 d，观察其急性毒性症状谱，记录小鼠累计死亡数及小鼠体质量变化。结果THAA、粗提物均无法得出半数致死量。观察期间各组小鼠未见中毒反应，无动物死亡；给药14 d后解剖肉眼未见脏器异常；空白组与各给药组间的脏器指数评价及小鼠体质量变化比较，差别无统计学意义(P<0.05)。结论THAA及粗提物的小鼠灌胃给药最大耐受剂量分别为90.0，80.4 g·kg-1·d-1，分别相当于临床60 kg人每公斤体质量日用量的360.0倍及321.6倍。THAA及THAA粗提物口服毒性小，临床剂量下用药安全可靠。

福建； 三叶青； 植物组成部分，地上； 抗炎剂(中药)； 植物提取物; 急性毒性试验; 小鼠

在中药新药研究中，急性毒性试验是药物安全性评价的第一步，是评价单次或24 h内多次累积给药后动物表现出的毒性反应，通过测定半数致死量(lethal dose 50%,LD50)观察动物急性毒性的中毒表现，为临床试验剂量设置和不良反应监测提供参考依据。药用植物三叶青(Tetrastigmatishemsleyani)属于葡萄科崖爬藤属植物，是我国特有的珍稀药用植物。三叶青在浙江、福建等省份民间素有药食两用习俗，近年来临床多应用于抗肿瘤、抗病毒、抗感染性疾病等[1-2]。课题组前期研究证实，经课题组提制纯化的闽产三叶青地上部分有效部位提取物具有良好的体内抗炎作用[3]。为评价其安全性，实验依据中药、天然药物毒性研究相关指导原则[4]，对闽产三叶青地上部分抗炎提取物(anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part，THAA)及闽产三叶青地上部分粗提物(简称粗提物)进行急性毒性试验研究，采用最大耐受量(maximal tolerance dose，MTD)试验法，通过最大给药浓度及最大小鼠灌胃体积给药，观察小鼠的急性毒性反应[5]，初步评价THAA的口服用药安全性，以期为临床合理用药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1动物 昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，健康适龄，体质量21～25 g(上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号2015000520265)。饲养环境温度(22±2)℃，环境湿度(65±5)%，保持室内自然通风，自由饮食、饮水。清洁级医学实验动物环境设施由福建中医药大学实验动物中心提供[许可证号 SCXK(沪)2012-0002]。实验动物处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.1.2试剂 THAA(自制，批号20150205，总黄酮含量60.0 %)；粗提物(自制，批号20141115，总黄酮含量12.8 %)；氯化钠注射液(0.9 %，批号120624A04,福州海王福药制药有限公司)。

1.1.3仪器 万分之一电子天平(AR2140)及百分之一电子天平(ARA520)(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1药液的制备 分别称取THAA、粗提物，临用时加蒸馏水50 mL配制成混悬液，并以灌胃针测试至可吸取的浓稠度，即得THAA、粗提物的最大浓度药液(0.75及0.67 g/mL)。

1.2.2小鼠急性毒性LD50预实验 取昆明种小鼠 40 只，分为2组，雌雄各半，体质量 18～22 g，实验前分笼饲养3 d后，于第4天晚上小鼠禁食不禁水12 h。次日早上，2组小鼠分别灌胃给药THAA药液、粗提物药液，各组按0.3 mL/10 g小鼠体质量灌胃给药1 次，常规饲养，连续观察7 d，拟找出100%死亡率进行LD50即Dm值的测定。

1.2.3急性毒性MTD法试验 取昆明种小鼠60只，体质量21～25 g，随机分为3组，即THAA组、粗提物组、空白组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养。小鼠试验前禁食不禁水12 h后，次日早上小鼠分别灌胃给药THAA最大浓度药液、粗提物最大浓度药液，灌胃给药最大容积0.3 mL/10 g；空白组灌胃给予等量的蒸馏水；24 h内灌胃给药3次，间隔8 h。给药后当天密切观察6 h内各组小鼠灌胃后的症状，给药第2天后每隔1 d观察1次，记录动物的行为活动、精神状态、被毛、摄食、饮水、呼吸、排泄物情况及鼻、眼、口腔有无异常分泌物、死亡及体质量变化等情况。小鼠急性毒性症状谱见表1。同时称量给药前、给药后第1，2，3，4，6，7，9，11及14天的体质量，观察小鼠体质量变化。若有小鼠死亡，立刻将死亡小鼠解剖，肉眼观察小鼠的心、肝、脾、胃、肾、胸腺等脏器。第 14天脱颈处死各组小鼠，对其主要脏器进行肉眼观察，比较病理变化，若发现肉眼可见病变，则进行病理组织形态学检查，同时称取各脏器湿重，计算脏器指数：

脏器指数=脏器湿重(mg)/体质量(g)

表1 小鼠反应症状指标

2 结 果

2.1小鼠急性毒性MTD症状观察 给药后10 min内，个别小鼠行动有所缓慢，但无不良反应；10～20 min，各组小鼠均逐渐恢复正常活动，饮食饮水均正常，对外界反应灵敏、兴奋，在鼠笼内攀爬；观察期间内无动物死亡。2周后处死全部存活小鼠，经解剖和尸检未发现内脏器官异常。

2.2小鼠急性毒性MTD值测定 根据THAA、粗提物小鼠给药剂量计算MTD值，结果THAA的MTD值为90.0 g·kg-1·d-1，粗提物MTD值为80.4 g·kg-1·d-1。

2.3小鼠急性毒性MTD体质量变化 小鼠给药后连续观察14 d，称取3组动物体质量。结果表明，给药组和空白组体质量变化无显著性差异(表2，图1)。

2.4小鼠脏器指数 与空白组比较，THAA组及粗提物组的小鼠各脏器的颜色、质地无差异，脏器指数无显著性差异(表3)。

表2 THAA、粗提物对小鼠急性毒性MTD实验体质量变化的影响

THAA:闽产三叶青地上部分抗炎提取物; MTD:最大耐受量.

THAA:闽产三叶青地上部分抗炎提取物. A：雌性； B：雄性.图1 MTD试验雌、雄性小鼠体质量变化图Fig 1 The curve of female or male mice body weight from MTD test

分 组性别小鼠脏器指数心肝脾肺肾胸腺空白组雌性4．3±0．246．7±1．13．6±0．26．4±0．210．2±0．23．8±0．2雄性4．8±0．246．5±1．63．6±0．26．3±0．410．8±0．64．2±0．1THAA组雌性4．2±0．146．7±0．93．6±0．26．7±0．210．3±0．24．2±0．1雄性4．6±0．347．8±1．93．9±0．26．7±0．210．7±0．64．5±0．2粗提物组雌性4．3±0．246．7±1．13．6±0．26．4±0．210．2±0．23．8±0．2雄性4．3±0．246．7±1．13．6±0．26．4±0．210．2±0．23．8±0．2

THAA:闽产三叶青地上部分抗炎提取物; MTD:最大耐受量.

3 讨 论

药用植物三叶青为我国特有的珍稀药用植物，为福建省特色中草药，属于葡萄科崖爬藤属植物。THAA是课题组经工艺优化制备的三叶青地上部分抗炎有效部位，总黄酮含量平均约60%，具有良好的抗炎镇痛作用。THAA初步安全性预实验以最大给药浓度、最大给药体积1次口服灌胃，无Dm值(100%死亡率)，故选用MTD法进行THAA急性毒性试验研究。

急毒试验以40 mL/kg对小鼠灌胃给药THAA及粗提物，个别小鼠发生腹部收缩现象，分析原因是由于药液粘稠度较大而使胃胀导致，几分钟后即可缓解，故判断并非药物的毒性所致，因此实验最终选择最大给药容量为30 mL/kg体质量进行小鼠灌胃。

根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》进行MTD法的测定，采用小鼠最大耐受药量倍数计算，以耐受人临床用药量的100倍以上为安全[4]。急性毒性试验结果表明，小鼠THAA的MTD为90 000 mg/kg，粗提物为80 400 mg/kg，比较三叶青成人(体质量以60 kg计)以民间食用习惯的日口服最大剂量15 g计算,THAA、粗提物MTD分别相当于临床用量的360倍及321.6倍，说明THAA、粗提物的毒性低，口服用药安全。

[1] 蔡韦炜,陈 丹,范世明,等.三叶青地上部分化学成分分析[J].福建中医药大学学报,2013,23(5)：34-35,42.

[2] 蔡韦炜,陈 丹,范世明,等．中药三叶青化学成分及药理作用研究进展[J]．天津药学,2014,26(1)：38-41．

[3] 廖淑彬,蔡韦炜,陈 丹,等．闽产三叶青地上部分提取物体内抗炎镇痛作用研究[J].中国现代应用药学,2017,34(3):319-324.

[4] 国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则[S].北京:中国医药科技出版社,2006：209-216．

[5] 连赟芳,陈 丹,郑 利,等．玳玳黄酮滴丸的急性毒性试验[J].福建中医药大学学报,2014,24(1):24-26.

AcuteToxicityTestsofAnti-inflammatoryExtractsofTetrastigmatisHemsleyanum’sAerialPart

CHENHong1,LIAOShubin2,CHENDan2,XIEPing2,HUANGJiao2

1.InstituteofSenileDisease,FujianProvincialHospital,Fuzhou350001，China;2.DepartmentofPharmacy,FujianUniversityofTCM,Fuzhou350122，China

Objective To observe the acute toxicity of anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part in mice, and evaluate the drug safety.Methods60 Kunming mice, half male and half female, were randomly divided into drug groups and blank group according to body mass. The drug groups

anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part by gavage for 3 times a day, interval of 8 hours, and the volume of administration was 0.3 mL/10 g, and the concentration of administration was 0.67 g/mL of anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part and 0.75 g/mL of crude extracts. The blank group received distilled water, and the volume of administration was 0.3 mL/10 g. For 14 days, the toxic reaction and death number of mice were recorded.ResultsThe LD50 can’t be drawn in anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part and crude extracts, during the 14 days, toxic reaction and death were not appeared in mice. After 14 days, abnormal viscera were not found by naked eye after anatomy, and there was no significant difference in evaluation of viscera index and mouse weight change between drug group and blank group.ConclusionThe maximal tolerance dose of anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part and crude extracts are 90.0 g·kg-1·d-1and 80.4 g·kg-1·d-1in mice, respectively, which is equal to 321.6 times and 360.0 times of human (weighted 60 kg) daily dried medicinal herb expenses. The oral toxicity of anti-inflammatory extracts ofTetrastigmatishemsleyanum’saerial part and crude extracts is small, and its clinical dosage is safe and reliable.

Fujian；Tetraatigmahemsleyanum； plant components,aerial； anti-inflammatory agents(tcd)； plant extracts； acute toxicity tests； mice

R05； R332； R282.71； R285

A

1672-4194(2017)05-0287-04

2017-04-11

福建省科技计划项目(2010Y2004)；中管局中药分析学重点学科校管课题(X2014096-学科)

1.福建省立医院 干一科，临床老年病研究所,福州 350001；

2.福建中医药大学 药学院,福州 350122

陈 红,女,副主任医师

陈 丹. Email:gscd2@163.com

(编辑:张慧茹)