奶制品中蛋白质含量测定方法的研究进展

张巍伟,姜 泓

(中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122)

奶制品中蛋白质含量测定方法的研究进展

张巍伟,姜 泓*

(中国医科大学 公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122)

蛋白质是奶及其制品的主要营养成分. 现阶段奶及其制品中非蛋白氮、水解蛋白的掺假行为屡见不鲜，主要是由于缺乏奶及其制品中蛋白质精准定量的方法. 本文着重对奶及其制品中蛋白质定量方法进行归纳总结，主要介绍色谱法、分光光度法、滴定法和酶联免疫法的研究进展，比较各类方法的优缺点，为准确有效地对奶及其制品中的蛋白质进行定量测定提供参考.

奶制品；蛋白质；检测方法；含量测定

蛋白质是人体极为重要的营养素. 具有构成和修复身体组织、构成生理活性物质、调节渗透压和供给能量等生理功能. 蛋白质均含有碳、氢、氧、氮四种元素，部分含有硫、铁、铜、磷等元素，其中氮元素在蛋白质中含量最恒定，约占16%，故蛋白质的定量方法常根据氮元素的含量进行推算. 奶及其制品因富含丰富的蛋白质(见表1)，营养价值较高，成为现代人的生活必需品，如，牛初乳被赞誉为“乳珍”、“乳白金”、“乳中奇葩”等[1-2]. 此外，随着现代生活节奏的不断加快，婴幼儿奶粉成了哺乳期工薪阶层女性的主要选择，然而随着2008年三聚氰胺事件的爆光，给中国乳业的发展带来重创，也反映出我国奶及其制品蛋白质含量测定方法的不足，让不法商贩为牟取商业暴利有可乘之机. 因此，建立准确、特异、高效、快速的乳及其制品中蛋白质含量的测定方法具有重要意义，本文综述了近年来奶制品中蛋白质含量的检测方法.

1 色谱法

色谱法(Chromatography)又称“色谱分析法”、“层析法”，是一种物理或物理化学分离分析方法，用于分离多组分的试样. 其原理是利用各种物质在两相中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，待分离物质在两相中进行多次反复的分配来达到分离的目的. 较常用的有高效液相色谱法、生物质谱技术、毛细管电泳法和阴阳离子交换色谱法.

表1 牛奶中蛋白质种类、含量、组成及功能Table 1 Milk protein species, content, composition and function

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱(HPLC)是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析[9]. 康孟丹等[10]建立HPLC测定牛初乳乳清蛋白粉中免疫球蛋白(Immunoglobulin-G，IgG)的含量，流动相为0.05 mol/L磷酸盐缓冲液和0.05 mol/L甘氨酸盐缓冲液，检测波长为278 nm，检出限为0.3 μg，且在0.1～1.0 mg/L范围具有良好线性关系，所建方法快捷、简便、灵敏度高，能够准确测定IgG的含量. 王浩等[11]采用凝胶过滤-HPLC测定牛奶及制品中的α-乳白蛋白(α-Lactalbumin，α-La)和β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin，β-Lg)的含量，分离度为1.0，回收率可达到90%. 赵海霞等[12]采用C8色谱柱，流动相为0.1%的三氟乙酸-水溶液和0.09%的三氟乙酸-乙腈溶液，梯度洗脱，在215 nm检测波长下测得检测限、定量限分别为3 mg/L、10 mg/L，为定量测定α-La和β-Lg含量提供有效方法.

高效液相色谱法具有分离效率高、选择性好、灵敏度高等优点. 但所用检测器常为紫外检测器，且蛋白质分子结构错综复杂，经常发生结构变性，在分离过程中易造成死吸附，常出现实验结果回收率低和分离度差等问题.

1.2 生物质谱技术

随着质谱技术的不断改进和完善，质谱的应用范围已扩展到生命科学研究的许多领域，特别是质谱在蛋白质领域的应用，不仅为生命科学研究提供了新方法，同时也促进了质谱技术的发展. 电喷雾电离(Electrospray Ionization，ESI)和基质辅助激光解吸电离(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI)这两种软电离技术的出现，使生物大分子的离子化得以实现[13]，一种基于生物标志物的生物质谱技术应运而生. 目前，生物质谱技术已广泛应用于生物大分子研究领域，为蛋白质组学的研究及蛋白标志物的分离纯化与定量分析提供有效手段. 现阶段三重四级杆质谱(Triple quadrupole mass spectrometry，QQQ-MS)广泛用于蛋白质的定量. 即对蛋白质酶解或降解后所得多肽混合物进行质谱分析，采用多反应检测模式(Multi-reaction mode，MRM)对特异肽段进行检测，从而对相应蛋白质进行定性定量. 此外，随着生物信息学技术的发展，质谱技术除了用于蛋白质的质量测定外，还广泛地用于肽指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)以及氨基酸序列测定. 在PMF鉴定蛋白质中，目前最常用的方法是，采用 2-DE 技术将酶切得到的肽段进行分离，再利用 MALDI-TOF-MS进行分析，将实际水解肽段与多肽蛋白数据库中蛋白质的理论肽段进行比较，判别所测蛋白质是已知还是未知，从而对蛋白质进行鉴定和高通量筛选. 安美忱等[14]建立高效液相色谱-基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(HPLC-MALDI-TOF/TOF MS)分离鉴定牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferricin，Lfcin B)的方法，分离得到高活性的Lfcin B，其相对分子质量为3 124.89，蛋白含量为18.20 mg/L. CHRISTOPH C等[15]建立适用于牛乳、全乳、婴儿酸奶食品中β-Lg含量测定的HPLC-MS联用方法，从BLAST数据库中寻找与牛乳中β-Lg物理化学性质相似的蛋白作为内标，弥补了在提取过程中所造成的β-Lg损失，对β-Lg进行绝对定量. REN等[16]建立UHPLC-MS联用方法同时测定乳制品中α-La、β-Lg的含量，采用线性洗脱的方法改变流动相(A:0.1%三氟乙酸溶液，B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液)的比例，选择人乳α-La作为内标肽段，结果表明该方法在0.15～0.19 mg/L浓度范围内线性关系良好R2≥0.9991，回收率为94.0%～98.7%，准确度RSD≤11.1%，重复率RSD≤5.7%，可准确定量乳清蛋白含量，并应用于婴幼儿奶粉中蛋白质α-La和β-Lg的含量检测. FELFOUL等[17]应用LC-MS联用技术，对骆驼乳和牛乳中的α-La、β-Lg和Caseins进行检测，研究表明经过80 ℃加热60 min后，骆驼乳和牛乳中α-La、β-Lg均无法检测到，而酪蛋白(Caseins，CNs)却可保持其完整性被LC-MS检测并定量，得出高温处理会导致乳清蛋白大量损失，提示对乳清蛋白进行前处理时应避免高温加热或者采用内标对回收率进行校正. LINX等[18]采用定性LC-TOF-MS/MS联用技术对乳清蛋白中产生苦味的成分进行分析，结果显示产生苦味的氨基酸序列分别是源自α-La、β-Lg、血清白蛋白(SA)和β-Casein的YGLF，IPAVF，LLF和YPFPGPIPN肽段，并确定YGLF、IPAVF、LLF和YPFPGPIPN的浓度分别为0.66、0.58、1.33和2.64 g/kg，同时表明在10%乳清蛋白溶液中，上述四种肽段序列苦味强度高达88%.

生物质谱技术具有检测准确、快速、方便的优点，但其消耗品较昂贵，对设备的检测状态及维护条件要求较高，限制其广泛的应用于食品质量检测监督局及相关领域.

1.3 毛细管电泳法

毛细管电泳(Capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳(High performance capillary electrophoresis ，HPCE)，是以弹性石英毛细管为分离通道，以高压电场为驱动力，依据样品中各组分之间电泳速度及分配行为上的差异而实现分离的电泳分离分析方法. 张东送等[19]运用CE快速分析牛乳中的蛋白组分，检测牛乳中添加杂蛋白的掺假情况，并绘制出原料乳、巴氏乳和超高温乳的毛细管区带电泳图谱，利用32Karat软件计算出乳中酪蛋白的含量，并可检测乳粉中是否添加大豆蛋白. 孙国庆等[20]利用毛细管电泳法分别测定1～12月份牛乳样品中α-La和β-Lg含量，发现牛乳中α-La和β-Lg含量与气候温度负相关. 唐萍等[21]将柠檬酸作为缓冲体系，可很好地分离出牛奶中α-La、β-Lg、α-酪蛋白(α-Casein，α-CN)、β-酪蛋白(β-Casein，β-CN)和κ-酪蛋白(κ-Casein，κ-CN).

毛细管电泳法具有快速、高效、进样量少、经济等优点；但灵敏度相对较低，准确度较差，常因柱内壁易吸附碱性蛋白等生物大分子而较少用于蛋白质、核酸的分离.

1.4 阴阳离子交换色谱

离子交换色谱法是将离子交换原理与液相色谱技术结合而来的测定溶液中阴、阳离子的一种分离分析方法，不仅可用于无机离子混合物，还可用于有机离子混合物的分离. 赵凌国等[22]采用0.2 g purolite C115E离子交换树脂，用500 mg/L乳铁蛋白(lactoferrin，LF)标品对毛细管柱进行动态涂层，5% NaCl溶液在pH=6.0的酸性条件下进行洗脱，最佳孵育时间定为120 min，可准确检测出牛奶中LF的含量. 由于该法通过离子交换分离混合物，故对于分子型混合物难以达到较好的分离效果.

离子交换色谱法的优势在于吸附容量大，固定相吸附力较温和，洗脱时不易破坏蛋白质及酶的活性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备；劣势在于交换层析介质不同，导致蛋白质分离效果不同，易造成蛋白峰的重叠，导致分离纯度下降.

2 分光光度法

分光光度法又称吸收光谱法，是对被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的吸光度或发光强度的测定，从而对被测物质进行定性和定量分析的方法. 该方法是以Lambert-Beer定律为理论基础，通过检测光源经过待测物质前后吸光度的变化对无机、有机化合物进行定性定量分析或结构鉴定. 较常用的为紫外-可见分光光度法，近红外分光光度法.

2.1 紫外-可见分光光度法

紫外-可见分光光度法是检测吸收波长在190～800 nm范围内待测物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法. 当光透过被测物质溶液时，物质对光的吸收程度随波长的变化而变化. 因此，通过测定物质在不同波长处的吸光度，确定最适检测波长，并绘制吸光度与波长的曲线图即得被测物质的吸收光谱. 由丹青[23]建立紫外分光光度法测定牛奶中添加水解蛋白(L-羟脯氨酸)的含量，该方法线性关系良好，检测限为0.2 μg/g，相对标准偏差RSD为0.48%～0.77%，加标回收率为93.13%～100.57%，可灵敏、准确、可靠的用于纯牛奶中L-羟脯氨酸的含量测定. 李良等[24]将GB/T 5009.5-2003中第一法(凯氏定氮法)和第二法(分光光度法)进行对比，结果表明二者无明显差异，第一法更适合测定少量样品，第二法更侧重于测定大批量样品中蛋白质含量. 在483 nm的检测波长下，冯旭东等[25]利用自主研发的蛋白质快速检测仪得出在17～40 ℃条件下，蛋白质试剂与蛋白质l min内即可完全反应，整个测定过程仅需5～10 min，测定结果的精密度(RSD)小于1%，与凯式定氮法测定结果和标准物质比较，测定结果的相对误差均小于5%，且不受三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸铵等非蛋白氮的干扰，同时表明蛋白质快速检测仪重复性较好，可用于乳制品中蛋白质含量的快速测定. 许家喜[26]总结出的五种蛋白质含量测定方法中，双缩脲法、Folin-酚试剂法和考马斯亮蓝法均为显色剂与待测物发生显色反应，根据吸光度的变化进行蛋白质含量测定，见表2. 陈育红等[27]利用双缩脲法在540 nm波长下测定吸光度值，根据标准曲线，计算出试样中蛋白质的含量. 刘莹等[28]建立了三氯乙酸-双缩脲比色法，可以准确测定出液体乳中添加水解蛋白、三聚氰胺、尿素、甘氨酸等非蛋白氮(nonprotein nitrogen，NPN)的蛋白质含量. 房列涛等[29]以酪蛋白为标准蛋白，选用双波长(测定波长600 nm，参比波长460 nm)代替单波长法，对考马斯亮蓝发进行改进，该法可消除游离考马斯亮蓝的干扰，增加测定结果的准确性.

表2 5种常用蛋白质含量测定方法的比较Table 2 Comparison of five common protein content determination methods

2.2 近红外分光光度法

近红外光谱分析技术是依据被检测样品中某一化学成分对近红外光谱区的吸收特性进行的定性、定量的一种检测方法. 近红外光谱吸收是由于分子振动能级的跃迁(同时伴随转动能级跃迁)而产生的. 近红外光(NIR)是指介于可见光(VIS)和中红外光(MIR)之间的电磁波，美国材料检测协会(ASTM)定义的近红外光谱的波长范围为780～2 526 nm，是人们最早认识的非可见光区域. 李双红等[30]利用近红外光谱扫描和多功能乳制品分析仪对不同胎次奶牛牛奶蛋白质含量进行测定，在正交实验设计的基础上，分别采用主成分回归法(PCR)、偏最小二乘法(PLS)、改进偏最小二乘法(MPLS)三种定量校正方法和多种光谱预处理方法联用建立数学模型，利用目标函数法对模型进行评定，发现一胎和二胎奶牛乳样中乳蛋白的最优模型相同，所建模型可应用于快速、准确、无损、定量检测原料奶中乳蛋白的含量，为快速检测混合原料奶中乳蛋白含量提供了理论依据. 单杨等[31]采用Kennard-Store法对样品进行校正集和预测集分类，小波变换法进行数据压缩与去噪，径向基神经网络建立蛋白质和脂肪预测模型，利用凯氏定氮法求出蛋白质含量，适用于奶粉脂肪和蛋白质含量的快速无损测定.

分光光度法的主要特点为灵敏度高，应用范围广，操作简便，分析成本低；然而其在准确度，专一性，干扰物质的影响方面有待提高.

3 滴定法

滴定法分为自动电位滴定法和人工滴定法两类. 其原理主要是根据指示剂颜色变化确定滴定终点，根据标准溶液的消耗体积进而推算出待测物质的浓度. 传统的凯氏定氮法误差较大，且不能区分蛋白氮与非蛋白氮，具体见表2[26]. 因此，高美玲等[32]针对GB/T 5009.5-2003中第一法(凯氏定氮法)的不足，对凯氏定氮法进行优化，在含量测定前将牛乳样品pH调节为4.8，加入5倍于牛乳体积的95%乙醇沉淀蛋白质，过滤后用浓硫酸消化蛋白质沉淀，该法能简便、快速、准确地检测出牛乳中纯蛋白质含量. 周晓琳等[33]将凯氏定氮法的反应条件进行优化，消化液用量为10 mL，硫酸钾和硫酸铜的用量分别为8 g和0.5 g，硼酸接收液的浓度为30 g/L，用量20 mL，蒸馏时间为10 min，经优化后的方法能保证奶粉中高蛋白含量的检出.

由于手动滴定法的系统误差较大，人们在传统凯氏定氮法的基础上研制出全自动凯氏定氮仪，弥补了耗时长，溶液消耗量大的缺点. 王静等[34]使用全自动凯式定氮仪对生鲜牛乳中非蛋白氮进行测定，弥补了手动滴定误差较大的缺点，该法与GB/T 21704-2008相比，节省试剂超过50%，缩短了分析时间，提高了分析效率. 刘正等[35]使用全自动定氮仪与半微量蒸馏法对多种乳制品进行蛋白质含量测定，可准确、快速测量出蛋白质含量. 何莉萍等[36]依据十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)可破坏蛋白质胶粒的水化膜，使其失去稳定性而沉淀的原理，探究用SDS快速检测奶粉中蛋白质含量的实验条件，筛选确定溶液pH<3，反应温度在15～30 ℃范围内，标准曲线线性关系良好，在4 min内完成奶粉中蛋白质的检测.

4 酶联免疫吸附法

酶联免疫吸附法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)最初是由瑞典学者ENGVAIL和PERLMANN，荷兰学者VAN WEERMAN和SCHUURS在1971年分别提出，将免疫技术应用于检测体液中微量物质的固相免疫测定方法. 其原理是将抗体与酶复合物结合，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析. 目前，已有相关文献报道将ELISA法应用于牛初乳中IgG和母乳中LF蛋白的含量测定. 马智伟等[37]采用凝乳和超滤工艺，对样品前处理方法进行改进，以便获得高浓度IgG，利用ELISA法(HRP-兔抗牛IgG作为二抗)在492 nm波长下测定吸光度，从而确定IgG的含量，为工业化生产高浓度IgG初乳粉提供了可行工艺. 单炯[38]利用ELISA双抗体夹心法在450 nm波长下测定母乳中LF含量，结果表明以初乳中LF含量最高，过渡乳其次，成熟乳最低，且母乳中LF含量仅与产妇的营养水平有关，与产妇年龄，婴儿体重，产妇种族无关.

ELISA法的优点在于酶催化效率极高，可极大限度地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度，且该法操作简单，专一性好，但由于抗原抗体结合具有特异性，因此该技术只能对已知特异性抗体的生物样品进行检测，且易受自身抗体和交叉免疫性的干扰[39]，常出现假阳性、假阴性结果. 与ELISA测定原理类似的还有琼脂单、双向免疫扩散法[40].

5 联合测定法

在实验过程中，采用一种方法往往不能满足我们对测定的需求，因此联合使用两种或多种方法测定乳制品中蛋白质的含量是一个不错的选择. 孙雯[41]将等电点法和凯氏定氮法联合使用，在pH=4.6，缓冲溶液为HAC-NaAc的条件下沉淀酪蛋白，在碱性条件下复溶，利用凯氏定氮法测定乳蛋白含量. 乐薇等[42]利用数码成像比色法将考马斯亮蓝染色后的蛋白质颜色深度转换为灰度格式，计算蛋白质的含量，用于牛乳中蛋白质含量测定，该法的相对标准偏差(RSD)小于2%，回收率在97.5%～102.6%之间，结果与考马斯亮蓝分光光度法测定结果一致，且更加简便、快速.

6 氨基酸折算法

除了以上方法之外，氨基酸折算法同样可用于乳制品中蛋白质含量的测定. Association of Official Analytical Chemists[43](AOAC)建立乳及婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白的检测标准是以乳清蛋白和酪蛋白中的4种特征氨基酸为理论基础，即依据天冬氨酸/天冬酰胺(Asx)、丙氨酸(Ala)、苯丙氨酸(Phe)和脯氨酸(Pro)的含量折算出婴幼儿配方奶粉中乳清蛋白的百分比. 计算公式如下：

R=(Asx+Ala)/(Phe+Pro)(1)

Asx为天冬酰胺的个数；Ala为丙氨酸个数；Phe为苯丙氨酸个数；Pro为脯氨酸个数

fw/%=100×(9.596-15.72R)/

(-6.111R-7.037)(2)

R为特征氨基酸的比值；fw为乳清蛋白质量分数.

李爽等[44]针对氨基酸折算法应用于婴幼儿奶粉中乳清蛋白的含量测定进行方法评估，结果显示，大豆分离蛋白会改变氨基酸的组成，对含有豆基配方粉的产品不适用，故氨基酸折算法只适用于乳基婴幼儿配方乳粉.

7 结语

总结归纳了色谱法、分光光度法、滴定法、酶联免疫等方法测定奶制品中的蛋白质含量，比较了这些测定方法的优缺点. 虽然在交叉学科的研究背景下，新建立许多操作简便、灵敏度好、准确度高、重现性好的检测方法，但部分测定方法存在应用费用昂贵、仪器要求较高、操作复杂等问题，不易被广泛应用于乳制品行业及相应食品质量监管部门. 因此，建立检测成本较低、可操作性强、应用范围广、准确可靠的蛋白质检测方法是乳制品行业的重点发展方向.

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Reviewonquantitationtechniquesforproteinindairyproducts

ZHANG Weiwei, JIANG Hong*

(SchoolofPublicHealth,ChinaMedicalUniversity,Shenyang110122,Liaoning,China)

Protein is a viral nutrient component of dairy products.At present, precise quantitative method in protein of the dairy products is shortage so that the behavior of adding the non-protein nitrogen, hydrolyzed protein in dairy products is not uncommon. This paper focuses on analyzing and summarizing the quantitative methods of protein quantification and adulteration detection in dairy products. The progresses of chromatography, spectrophotometry, titration and enzyme-linked immunoassay are introduced. Simultaneously, we analyse advantages and disadvantages of each method to effectively provide a reference for the quantitative method of milk protein in dairy products.

dairy products; protein; detection method; quantitation

R155.57

A

1008-1011(2017)05-0663-08

2017-06-14.

中华医学会医学教育分会和中国高等教育学会医学教育专业委员会2016年医学教育研究立项课题(2016A-YF002)；辽宁省高等教育学会“十三五”规划高教研究立项课题(GHZD160007).

张巍伟(1993-)，女，硕士生，研究方向为卫生检验学.*

，E-mail：hjiang@cmu.edu.cn.

[责任编辑：吴文鹏]