基于低共熔溶剂的液相微萃取-高效液相色谱法测定大豆油中的TBHQ

张康迪，刘 伟

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

基于低共熔溶剂的液相微萃取-高效液相色谱法测定大豆油中的TBHQ

张康迪，刘 伟*

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

建立了一种基于绿色低共熔溶剂的液相微萃取与高效液相色谱联用技术，用于测定大豆油中的合成抗氧化剂TBHQ。结果表明，氯化胆碱/乙二醇在物质的量比为1∶2时组成的低共熔溶剂对大豆油中的TBHQ具有较高的萃取率。最佳萃取条件为：低共熔溶剂用量400 μL，油用量0.15 g，萃取温度50℃，萃取时间30 min，正己烷用量 2 mL。检测限为 0.02 μg/mL，回收率在98.5%～112%范围内，日内和日间精密度均小于2%。该方法成功应用于市售大豆油样品中TBHQ的测定，接近于使用国标方法的测定结果。

低共熔溶剂；抗氧化剂；TBHQ；大豆油；液相微萃取

0 前言

众所周知，抗氧化剂是通过延缓由氧化引起的食品劣变来保护食物的物质[1]。抗氧化剂分为天然抗氧化剂和合成抗氧化剂，其中油脂中常使用合成抗氧化剂，如 BHA、BHT、TBHQ 等[2]。TBHQ 是油脂抗氧化能力最强、使用最广泛的一种合成抗氧化剂。大量研究证明：TBHQ具有不会引起油脂变色、抗氧化能力强、稳定性好等优点。但是，毒理学研究显示，TBHQ在动物试验中有一些副作用，如造成动物的胃肿瘤和DNA损伤[3]。因此，对油脂中TBHQ的添加量有严格限定，不允许过量添加。美国FDA规定，TBHQ在食品中使用的最大限量为油脂或食品中脂肪含量的0.02%。我国从1991年开始允许TBHQ作为添加剂用于油脂行业，最大使用限量为200 mg/kg。

现阶段，对油脂中的酚类成分的检测方法主要是先进行液-液萃取，然后用高效液相色谱分析仪进行检测。常用的萃取剂有乙腈、甲醇等传统有机溶剂，但是这些萃取剂具有较大的毒性，试验过程中对操作人员产生一定的毒害，且对环境也会造成污染。随着全社会环保意识的增强，人们更希望能找到一种绿色无污染的新型溶剂来代替这些毒性较大的传统溶剂。

2003年，Abbott等[4]首次发现了一种由季铵盐（如氯化胆碱）和酰胺化合物（如尿素）形成的物理化学性质优良的溶剂——低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES）。这种溶剂无毒，可生物降解，且合成过程原子利用率达100%，是一种新型的绿色溶剂。低共熔溶剂的制备过程简单，将一定物质的量比的季铵盐和氢键供体混合，在一定的温度下搅拌直至形成均一透明液体即可，无需纯化即可直接使用。与离子液体相比，低共熔溶剂具有低挥发性、低熔点、高热稳定性、选择性溶解能力以及合成简单、成本低、无毒性、可生物降解、环境友好等诸多特点[5-7]，在众多领域中显示出广阔的应用前景。随着人们对低共熔溶剂性质研究的不断深入，其在分离提取过程中显示出较强的优越性，特别是在油脂中酚类化合物的提取过程中[8-9]，如从棕榈毛油中提取维生素E[10]，测定橄榄油中的总酚含量[11]等。但是应用于食用油脂中合成抗氧化剂TBHQ的提取及测定还未见报道，故作者使用低共熔溶剂对大豆油中的TBHQ进行萃取，并采用高效液相色谱法进行分析，以期为分析检测油脂中的抗氧化剂TBHQ提供新的方法和思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆油：河南阳光油脂集团有限公司；TBHQ（HPLC，纯度≥99.00%）：美国Sigma-Aldrich公司；氯化胆碱（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；尿素、甘油、乙二醇、1.2-丙二醇、乳酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：美国生物VBS天津景隆元科技发展有限公司；正己烷（色谱纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；纯净水：娃哈哈集团。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱分析仪、Waters 2489紫外检测器：美国Waters公司；SCQ-250B超声仪：上海生彦超声仪器有限公司；TDL-80-2B型低速离心机：上海安亭科学仪器厂；BSA224S电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；磁力搅拌器：IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 DES的制备

将氯化胆碱与氢键供体（如尿素、甘油、乙二醇、乳酸、1.2-丙二醇、水）按照一定的物质的量比混合（表1），加热搅拌直至形成均一透明的液体。

表1 不同组成的DESTable 1 Compositions of different DES

1.3.2 TBHQ的萃取方法

准确称取一定量的油样于磨口具塞三角瓶中，并用正己烷溶解，加入一定量的低共熔溶剂，萃取，在 3 000 r/min下离心10 min，取 DES相用高效液相色谱仪分析。

1.3.3 抗氧化剂的HPLC检测[12]

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×5 μm×4.6 mm）；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。采用梯度洗脱，流动相A：甲醇，B：0.5%乙酸水，其中A：0～7 min，40%～80%；7～15 min，80%～100%；15～20 min，100% ；20 ～28 min，100% ～40% ；28 ～40 min，40%。

1.3.4 数据处理

所有试验均重复3次，所有数据用平均值±标准偏差表示。建立TBHQ的标准曲线，计算油脂中TBHQ的萃取率。

2 结果与讨论

2.1 萃取方式的选择

萃取方式直接影响目标物的萃取效率。超声波在介质中传播，穿过介质时，产生空化作用，从而细化物质，加速目标成分进入溶剂，提高提取率。恒温摇床萃取方法是对两相液体进行摇动振荡，使两相不相溶的液体充分接触。分别使用这两种方式对大豆油中的TBHQ进行萃取。结果表明，超声萃取可以较快达到最大的萃取效率，且其在食品药品分析检测领域应用广泛，故采用超声萃取方式进行后续试验。

2.2 DES的选择

溶剂体系的选择由样品材料中提取的目标化合物的性质决定。在相同的超声萃取条件下，由图1可知，6种溶剂中TBHQ萃取率最高的组分是DES-3（氯化胆碱/乙二醇），萃取率达到85.09%。原因是氯化胆碱/乙二醇物质的量比为1∶2形成的低共熔溶剂的黏度比较小，流动性好，扩散率大使得其对大豆油中TBHQ有更好的提取效果。比较不同低共熔溶剂的萃取率，可以得出氯化胆碱/乙二醇组成的低共熔溶剂的萃取效果最好。此外，有研究表明，向低共熔溶剂中加入一定量的水可以降低其黏度，在某些情况下可以提高目标物萃取效率。因此，向低共熔溶剂中加入水，研究其萃取效果。结果显示，含水的低共熔溶剂（DES-6）的萃取效率明显低于不含水的萃取效率（DES-3）。因此本研究选择氯化胆碱/乙二醇组成的低共熔溶剂作为最佳萃取溶剂。

图1 溶剂种类对萃取率的影响Fig.1 Effect of extraction solvent on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.3 萃取温度的选择

在该萃取体系中，适当升高温度可以使低共熔溶剂的黏度下降，使得低共熔溶剂有更好的流动性，从而使溶剂与油样的传质更加充分，使提取更加彻底，从而提高萃取效率。从图2可以看出，随着温度的升高，TBHQ的萃取率先逐渐升高，到达50℃后趋于平稳。所以，在研究中选择50℃作为提取的最佳温度。

图2 萃取温度对萃取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.4 萃取时间的选择

在一定时间范围内，随着时间的延长可以使反应更加充分，提高萃取效率。从图3可以看出：大豆油中TBHQ的萃取率随时间的延长先增大后稍有减小，这是由于在一定时间范围内，萃取时间越长，使得低共熔溶剂萃取目标化合物越充分。然而，操作时间过长，会导致反应体系中的TBHQ发生少量氧化损失。萃取时间在30 min时萃取效率达到最大值，为91.77%。

图3 萃取时间对萃取率的影响Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.5 低共熔溶剂用量的选择

从图4可以看出，萃取率随着低共熔溶剂加入量的增加而增加，当达到一定值时，TBHQ的萃取率趋于平稳，这是由于当油样的量不变时，萃取溶剂量过少，导致油样与萃取剂接触不够充分；也可能是萃取剂所能溶解的TBHQ已经达到饱和状态而造成萃取率偏低。但是如果加入萃取剂过多会消耗超声能量同时也会导致萃取剂的浪费，在本研究中，低共熔溶剂的最适用量为400 μL，TBHQ萃取率达到93.23%。

图4 低共熔溶剂用量对萃取率的影响Fig.4 Effect of the DES amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.6 油用量的选择

图5是油样用量对萃取率的影响，随着油样的用量从0.5 g减少到0.08 g时，TBHQ的萃取效率逐渐提高，当油样用量为0.15 g时，TBHQ的萃取效率达到103%，最接近真实值，因此，在萃取过程中选择0.15 g作为油样的最佳用量。

图5 油样用量对萃取率的影响Fig.5 Effect of oil amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.7 正己烷用量的选择

为了使萃取过程中传质更加充分，加入正己烷来稀释油样，正己烷用量对萃取率的影响见图6。如图6可知，不加正己烷的萃取率明显低于加入正己烷的萃取率。当正己烷的量在一定范围内时，随着正己烷加入量的增加，TBHQ的萃取效率先增加后趋于平稳。因此，加入2 mL正己烷可使萃取效率更高。

图6 正己烷用量对萃取率的影响Fig.6 Effect of n-hexane amount on the extraction efficiency of TBHQ from soybean oil

2.8 方法表征

为了更好地评价该萃取方法，设计了一系列试验进行表征，包括线性关系、回收率、精确度、检测限（LOD）和定量限（LOQ）。通过外标法在 0～500 mg/kg范围内校准曲线，用HPLC-UV法分析。线性回归方程为y=7 648.9x-9 884.4，其中y是分析物的峰面积，x是分析物的浓度（μg/mL）。TBHQ显示出良好的线性关系，相关系数（R2）为0.999 8。TBHQ最低检出限为0.02 μg/mL，最低定量限为0.06 μg/mL。为了评估回收率，向大豆油中加入3种不同浓度标准溶液，每个样品测定3次，计算TBHQ的加标回收率。如表2所示，得到了在98.5%～112%范围内较高的加标回收率。此外，还测定了日内和日间精密度。对于日内精密度，大豆油样品在同一天测定6次，TBHQ浓度的RSD为1.1%。对于日间精密度，在5个不同工作日测定样品，RSD为1.7%。显然，该萃取方法具有较高回收率和精密度，适用于大豆油中TBHQ的定量分析。

表2 加标回收率的测定Table 2 Recovery rate of TBHQ

2.9 实际样品检测

从当地超市购买了6种大豆油来测定其中TBHQ的含量，结果如表3所示。同时，与传统方法（甲醇萃取）测得的TBHQ含量进行了对比，发现基于低共熔溶剂的萃取结果与传统方法得出结果极为相近。但是，与传统溶剂萃取方法相比，基于低共熔溶剂的萃取方法所需油样量（0.15 g）和萃取溶剂的量（400 μL）较少，更加符合微萃取的概念。因此，基于低共熔溶剂的微萃取方法是一种高效、低成本和环境友好型的绿色萃取技术。

表3 实际样品检测Table 3 Sample detection

3 结论

本研究采用基于低共熔溶剂的超声微萃取技术成功从大豆油中提取TBHQ，并使用HPLC-UV方法进行检测。由氯化胆碱和乙二醇组成的DES在优化条件下表现出较高的提取效率，其萃取率接近100%。在实际样品分析中，其测定结果接近国标方法。此外，将DES溶剂直接注入反相HPLC系统进行分析，不涉及相转化过程，可极大地简化样品预处理过程，表明DES是一种用于提取油脂中抗氧化剂TBHQ的理想溶剂。

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DEEP EUTECTIC SOLVENT BASED SOLVENT MICROEXTRACTION-HPLC MEDTHOD FOR DETERMINATION OF TBHQ IN SOYBEAN OIL

ZHANG Kangdi ，LIU Wei
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou450001，China）

A green and inexpensive ultrasonic-assisted liquid-liquid microextraction （UALLME） technique based on deep eutectic solvents （DESs） was employed in the extraction and separation of TBHQ from soybean oils.The results showed that the deep eutectic solvents （DESs） composed of choline chloride / ethylene glycol at molar ratio 1∶2 had the highest extraction rate of TBHQ in soybean oil. In a typical experiment，400 滋L DES as extraction solvent was added to 2.0 mL sample solution containing 0.15 g soybean oil，extraction time was 30 min，extraction temperature was 50 ℃，and then ultrasonic-assisted extraction was applied. After centrifugation，DES phase containing TBHQ was directly analyzed by reverse phase high-performance liquid chromatograph-ultraviolet detector （HPLC-UV） and no phase inversion was involved，which could simplify the sample pretreatment process. This method was successfully applied to the determination of TBHQ in 6 soybean oil samples，and the results were close to those of conventional liquid-liquid extraction with methanol as solvent.The linearity，the intra-day precision，the recovery rate and the detection limit of this method were also evaluated.It was concluded that the method was stable and reproducible，which was suitable for the detection and analysis of TBHQ in soybean oil.

Deep Eutectic Solvent；antioxidant；TBHQ；soybean oil；solvent microextraction

TS 225.1 文献标志码：B

1673-2383(2017)05-0032-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20171030.0936.014.html

网络出版时间：2017-10-30 9:36:35

2017-02-24

河南省高等学校青年骨干教师资助计划（2014GGJS-058）；河南工业大学青年骨干教师培育计划（2014003）

张康迪（1993—），女，河南新乡人，硕士研究生，研究方向为脂质化学与品质。

*通信作者