不同光照处理对霍山石斛多酚含量积累的影响

陈传平，陈乃东，刘国瑞

(1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237005；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

不同光照处理对霍山石斛多酚含量积累的影响

陈传平1，陈乃东2，刘国瑞2

(1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237005；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012)

为探究不同光照处理对霍山石斛根、茎和叶中多酚的含量及种类的影响，分别采用红蓝光照和模拟自然光照处理霍山石斛根、茎和叶，用比色法测定其不同光照条件处理下的多酚含量，运用毛细管电泳仪，通过沉淀敲除法和制得的样品进行对照检测多酚种类。研究表明，霍山石斛根、茎和叶多酚含量依次增多，红蓝光照处理根、茎和叶各部分多酚含量比模拟自然光照处理的少，但多酚种类则是红蓝光照处理的较多。因此，不同光照对霍山石斛多酚的积累及种类有明显影响。

霍山石斛；毛细管电泳；多酚；光照处理；沉淀敲除

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseTang et Cheng)，又称米斛，主产于安徽省霍山县等地，是兰科石斛属的草本植物，有生津益胃、益智除惊、轻身延年、抗肿瘤、降糖保肝和抗白内障等多种功效[1-3]。多酚(Polyphenols)是植物的主要次生代谢产物之一，为多羟基酚类化合物的总称，有抗氧化、抗衰老、增强免疫力等作用，是石斛中重要的生物活性物质之一[4-6]。

文献检索发现，光照条件改变可以对植物次生代谢产物的积累产生影响[7-8]。本实验用模拟自然光、红蓝光分别处理霍山石斛，测定了其多酚的含量和种类，初步探究了光照条件与其多酚积累及种类的关系，为进一步研究霍山石斛多酚提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

两年生霍山石斛(2016年10月采自安徽省霍山县，品种经品种经安徽省皖西学院陈乃东博士鉴定为霍山石斛)，经盆栽4周预培养后，随机分组置模拟自然光及红蓝光下培养。模拟自然光组，用波长460～760 nm、光强300 lux LED灯光照射；红蓝光组，用波长630 nm(红色)、光强160 lux及波长460 nm(蓝色)、光强160 lux LED灯光同时照射；两组光照时间均为12 h/d，生长温度25 ℃/16 ℃(日/夜)[9]，同条件水肥培养。50 d后采集洗净、晾干，根、茎和叶分开，置电热恒温干燥箱中40 ℃烘至恒重，备用。

1.2 主要仪器

XPE-30、XPR-20、XPB-20型LED灯(深圳市格美芯光科技有限公司)，GJ14-DGF3006型电热恒温干燥箱(金坛市荣华仪器制造有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(金坛市国华电器有限公司)；FA-1004型电子天平(上海精科天平厂)；RE-52D型旋转蒸发器(上海浦沪仪器厂)；K1060型毛细管电泳仪(北京凯奥科技发展有限公司)；TU-1901双光束紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

1.3 主要试剂

无水乙醇(AR,上海振兴化工一厂)；乙酸乙酯(AR，国药集团化学试剂有限公司)；无水三氯化铁(AR，国药集团化学试剂有限公司)；甲酸(AR,天津博迪化工股份有限公司)；甲醇(色谱纯，上海星可生化有限公司)；福林酚(MYM生物科技有限公司)；没食子酸标准品(上海金穗生物科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 石斛中多酚的提取

烘干至恒重的霍山石斛根、茎和叶，粉碎过30目筛。

天平称取一定量的不同方法处理的石斛根、茎和叶，置于250 mL烧瓶中，按料液比1∶15(g/mL)加80%乙醇， 80 ℃条件下冷凝回流提取3次，每次1.5 h。合并提取液，减压浓缩至适量，置于烧杯中挥去剩余乙醇，倒入容量瓶中蒸馏水定容，得总多酚提取液，4 ℃保存[10]。

1.4.2 石斛多酚含量的测定

采用Folin-Ciocalteu比色法测定样品中总多酚的含量[11]。称取没食子酸标准品，配置成25 ug/mL的没食子酸标准溶液。分别取0.0、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5、3.0 mL没食子酸标准品于10 mL容量瓶中，依次加入2.5 mL福林酚试剂，2 mL 7.5%的NaCO3(4～6 min内)和1.0 mL 甲醇，最后加H2O至10 mL，在黑暗中反应60 min， 517 nm处测定吸光度值(A)。以吸光度值为纵坐标(Y)，多酚含量为横坐标(X)，绘制没食子酸标准曲线。取1.0 mL总多酚提取液，按同样方法测定A，用H2O作空白对照，每组测三次取平均值，根据标准曲线计算不同光照处理的霍山石斛根、茎和叶多酚的含量。

1.4.3 毛细管电泳法测多酚的种类

1.4.3.1 样品预处理

分别取制备好的不同光照处过的霍山石斛根、茎和叶总多酚提取液一定量，真空干燥后，精密称取配置成1.0 mg/mL的水溶液，用0.45 μm纤维素膜过滤备用。

1.4.3.2 毛细管电泳条件的选择

根据文献[12]及预实验，选择硼砂作为缓冲溶液，测定波长为254 nm、分离电压15.0 KV、缓冲液pH为9以及离子浓度为0.1 mol/L作为毛细管电泳条件。

1.4.3.3 石斛多酚组分测定

将上述处理后的石斛多酚水溶液用注射器吸取放入Doff管中。毛细管电泳仪用0.3 mol/L的NaOH、H2O和缓冲液分别冲洗，预热3～5 min，设波长为254 nm，进样30 s，启动毛细管电泳仪，记录所得图谱。

1.4.3.4 未知石斛多酚组分的沉淀敲除鉴定

精密吸取1.0 mL石斛多酚配置成的水溶液，与三氯化铁沉淀试剂(2 mg/mL)等体积混合，摇匀，3 000 rmp离心10 min，重复三次操作获得敲除石斛多酚组分的上清液，用0.45 μm纤维素膜过滤。同上述测定未与沉淀试剂反应的不同光照处理的霍山石斛根、茎和叶用毛细管测定图谱方法相同，所得图谱结果与上述测定的石斛多酚提取物水溶液含量比较，消失或面积明显下降的峰为多酚类组分峰[13-14]。

2 结果与分析

2.1 霍山石斛多酚含量

没食子酸标准曲线见图1，实验中测得的不同条件光照处理的霍山石斛根、茎和叶多酚含量见表1。

由表1可知：模拟自然光照和红蓝光照处理的霍山石斛根、茎和叶多酚含量依次增多，其中模拟自然光照处理根、茎和叶中多酚含量较高，这可能是由于光照不同影响多酚的积累。

图1 没食子酸标准曲线

组分用量(g)总提液(mL)吸光度(A)含量(%)红蓝光石斛根7.309500.2030.735自然光石斛根3.3139500.2420.783红蓝光石斛茎2.73881000.2170.87自然光石斛茎1.03411000.1131.58红蓝光石斛叶1.5407500.21.28自然光石斛叶0.4284500.161.47

2.2 霍山石斛多酚组成的毛细管电泳分析结果

实验测得模拟自然光照处理霍山石斛根、茎和叶的多酚提取物HPCE分析结果见图2～4。

图2 自然光照霍山石斛根HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：模拟自然光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀试剂的根提取液

图3 自然光照霍山石斛茎HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：模拟自然光照霍山石斛茎提取液；c：加沉淀试剂的茎提取

图4 自然光照霍山石斛叶HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：加沉淀试剂的叶提取液；c：模拟自然光照霍山石斛叶提取液

由图2可见6～8 min峰2内敲除后的峰响应、峰面积值明显降低，表明模拟自然光照处理的霍山石斛根里含有1种多酚。图3中，敲除后的峰4、5、6、7和8响应、峰面积值有所降低，表明模拟自然光照处理的霍山石斛茎里含有5种多酚。图4可见敲除后的峰6、7、8、9、10、11、12和13响应、峰面积值明显降低，表明模拟自然光照处理的霍山石斛茎里含有8种多酚。图2～4比较，从峰面积来看茎中多酚含量较高，而多酚种类茎和叶中较多。

2.3 红蓝光照处理霍山石斛根、茎及叶的多酚提取物HPCE分析结果

实验测得红蓝光照处理霍山石斛的根、茎及叶的多酚提取物HPCE分析结果见图5～7。

图5 红蓝光照霍山石斛根HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：红蓝光照霍山石斛根提取液；c：加沉淀试剂的叶提取液

图6 红蓝光照霍山石斛茎HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：红蓝光照霍山石斛茎提取液；c：加沉淀试剂的茎提取液

图7 红蓝光照霍山石斛叶HPCE图谱注：a：三氯化铁沉淀试剂；b：红蓝光照霍山石斛叶提取液；c：加沉淀试剂的叶提取液

图5中，6～8 min时峰3、4敲除后有一个的峰的响应值和面积明显下降，表明红蓝光照处理的霍山石斛根里含有2种多酚。图6中，敲除后的峰8、9、10、14、15、16、17、18、19和20响应、峰面积值明显降低，表明红蓝光照处理的霍山石斛茎里含有10种多酚。图7可见敲除后的3、4、6、7、8、10、11、12、13、14和15响应、峰面积值明显降低，表明红蓝光照处理的霍山石斛茎里含有11种多酚。图5～7比较，其中根、茎和叶中有一种共有多酚(图5峰5、图6峰9和图7峰11)，从峰面积来看叶中这些种多酚含量最高。

上述结果表明，模拟自然光照和红蓝光照处理的霍山石斛根、茎和叶酚种类含量与种类都有所差别，其中红蓝光照处理的霍山石斛多酚种类要多，而含量则是模拟自然光照处理的较高。

3 讨论

本研究中，缓冲液pH的选择对样品出峰的效果有很大的影响，检测多酚物质时缓冲液pH要大于7，但太高会引起基线不稳。出峰的时间与电压、缓冲液浓度有关，电压太大出峰快但峰可能会有左右肩峰，缓冲液离子浓度大会加快出峰速度但相应电流会增加。最后，出峰时间还和毛细管的长度有关，毛细管越短，出峰越快。

研究表明，霍山石斛多酚具有较强的抗氧化活性，对DPPH和ABTS自由基的清除能力较强[15]。酚类化合物是一种天然抗氧化剂，其中多酚中酚羟基结构中的邻位酚羟基很容易被氧化成醌类结构，同时对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力，这使得多酚具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力，且抗氧化活性的强弱与其所含多酚类含量及种类具有较高的相关性[16]。

道地药材霍山石斛产业化发展目前尚处于起步阶段，已经制定了相关产地、种苗生产、栽培技术等标准[1-3,17]，但其在化学成分方面的鉴别和量化尚无明确标准。药用植物有效物质的合成与累积受自身遗传特征、自然环境、采收等多方面的影响，从而使有效物质的含量发生变化，影响到药材的内在质量。殷培蕾等人研究表明，光照不仅影响植物中多酚的种类和生物量，还会改变抗氧化活性[18]。本研究通过Folin-Ciocalteu比色法测定样品中总多酚的含量以及用毛细管电泳仪通过沉淀敲除的方法和制得的样品进样对照测定了多酚种类。结果发现霍山石斛的根、茎、叶在相同条件下出峰不同，不同光照处理的石斛相同部位峰也不太相同，模拟自然光照的霍山石斛多酚含量较红蓝光处理的要多，这可为探索霍山石斛产业化栽培条件及建立霍山石斛化学成分质量标准提供参考[19]。

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EffectofLightontheAccumulationofthePolyphenolsinDendrobiumhuoshanenseTangetChen

CHEN Chuanping1, CHEN Naidong2, LIU Guorui2

(1.WestAnhuiHeathVocationalCollege,Lu’an237005,China; 2.CollegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China)

[Objective] To investigate the effects of different light treatments on the accumulation of polyphenol in roots, stems and leaves ofDendrobiumhuoshanenseTang et Cheng, [Method] Respectively treated by red and blue light as well as imitation of natural light for 50 days, the polyphenols accumulating in the root, stems and leaves ofD.huoshanensewere analyzed by colorimetric method and high performance capillary electrophoresis combined with precipitation and knockout pretreatment. [Results] The accumulating rates of polyphenols were increased in the orders with root

Dendrobiumhuoshanense; capillary electrophoresis; polyphenols; light treatment; precipitation knockout

S567.2

A

1009-9735(2017)05-0006-04

2017-07-18

安徽省教育厅自然科学研究重点项目(KJ2015A361)；国家自然科学基金(81573536，81274021)；中国博士基金特别资助(第后9批)(2016T90559)；中国博士后研究面上项目(2014M551791)；安徽省自然基金面上项目(1608085MH221)。

陈传平(1972-)，男，安徽庐江人，副教授，硕士研究生，研究方向：天然产物开发与利用。