苹果矮化砧木抗寒性的评价与比较

李翠红，张永茂，冯毓琴，慕钰文，李长亮，魏丽娟

(甘肃省农业科学院 农产品贮藏加工研究所, 甘肃 兰州 730070)

苹果矮化砧木抗寒性的评价与比较

李翠红，张永茂*，冯毓琴，慕钰文，李长亮，魏丽娟

(甘肃省农业科学院 农产品贮藏加工研究所, 甘肃 兰州 730070)

【目的】研究不同苹果矮化砧木半致死温度与耐寒性的关系及抗寒性水平，以明确不同苹果矮化中间砧抗寒力，为筛选适合出甘肃省栽植的抗寒矮化砧木提供理论依据。【方法】以8个矮化中间砧1年生成熟枝条为试材，分别在-15、-20、-25、-30、-35 ℃条件下进行低温胁迫处理，以4 ℃冰箱处理的枝条为对照，测定不同低温处理下各个砧木电导率、游离脯氨酸、可溶性糖、蛋白质、丙二醛、SOD、POD酶活性等生理指标的变化。【结果】各个砧木抗寒性与相对电解质渗出率存在极显著负相关，与MDA 含量也存在及显著负相关；抗寒性与游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、POD和SOD存在极显著的正相关。【结论】通过系统聚类分析，在相似系数7.0水平上矮化砧木共分为3类，第1类为GM256。第2类： SH38、SH40、SH1、SH6。第 3类 ：T337、M9和M26。

矮化砧；抗寒性；评价；比较

【研究意义】矮化密植是当今世界苹果生产发展大趋势，通过矮化密植栽培可以获得苹果的高产、优质、高效。实现苹果矮化栽培的措施，一是利用苹果矮化砧木；二是利用苹果短枝型品种。在寒冷地区为了达到苹果结果早，产量高和产量稳定，通过各种途径，培育出既抗寒、又矮化的苹果矮化砧木，对提高苹果的抗寒能力具有重要的意义。【前人研究进展】由于苹果短枝型品种不多，因此，利用矮化砧木是实现苹果矮化密植栽培的主要途径[1-4]。在国外应用较多的矮化砧木有 M26、M9 等。在我国苹果产区生产应用的苹果矮化砧木是主要是 M 系和 MM 系，是20世纪 60 年代从英国引入的。从国外引入的这些矮化砧木，存在抗寒力较差，适应能力不强，在我国北部的苹果产区冻害有不同程度的发生，而在东北的寒地根本不能直接利用于苹果生产，使寒地苹果的矮化栽培技术发展缓慢。为了促进矮化栽培，培育自主产权的矮化砧木和紧凑型品种，我国各研究单位，从20世纪 60 年代开始进行了具有矮化资源的搜集和整理研究[5-8]。在我国由于不同地区气候条件差异较大，目前迫切需要选育抗寒性强的矮化砧木，为促进我国北方地区苹果矮化密植集约化栽培的进程，近年来，一些科研单位陆续在苹果抗寒矮化砧方面进行了研究，取得了很大的进展，通过对种质资源进行抗寒性鉴定和抗寒生理的评价等，引入和提出部分抗寒力较强的矮化砧木。但是，关于矮化砧资源的抗寒性研究报道较少。【本研究切入点】本研究以8个矮化中间砧1年生成熟枝条为试材，分别在-15、-20、-25、-30、-35 ℃条件下进行低温胁迫处理，以4 ℃冰箱处理的枝条为对照，测定不同低温处理下各个砧木电导率、游离脯氨酸、可溶性糖、蛋白质、丙二醛、SOD、POD酶活性等生理指标的变化，【拟解决的关键问题】通过对不同苹果矮化砧木低温处理下枝条的各个抗寒性指标进行测定分析和评价，比较和确定各个砧木的抗寒性，对较抗寒的矮化砧抗寒性进行了深入研究，有助于提出适宜寒地苹果生产应用的矮化砧木，同时为筛选出适合甘肃省栽植的抗寒矮化砧木提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2015年进行,供试材料为苹果的8种矮化砧木: M9、SH40、SH38、GM258、T337、M26、SH1、SH6。样品采自甘肃省静宁县城川乡大寨村苗木繁育基地。各样品均选取生长健壮、粗细均匀一致的1年生枝条。取样时间为 2015年6、7、8、9月，每月取1年生成熟枝条进行测定，共测定4次。

1.2 试验处理

参照梅立新等[9]的试验方法，将采集的枝条依次用自来水、蒸馏水冲洗，并用纱布擦干，每品种枝条分成4 组，每组 5 段枝条，用干净纱布包好放入塑料袋中，进行低温处理。试验设低温处理温度 -15、-20、-25、-30、-35 ℃ 设计 5 个处理。以 4 ℃/h 的速率降温，当温度降至处理温度并保持12 h 后，从低温冰箱取出置于0 ℃解冻4 h 后室温下放置 12 h 用于指标测定，其余样品继续以4 ℃/h 的速率降温到达设定温度后再保持12 h，再取出一批枝段，直到 -35 ℃ 为止。

1.3 指标的测定与方法

相对电导率测定：参照流畅等苹果抗寒矮化砧的评价与筛选[10]。相对电导率用DDS-307型电导仪测定[11]；蛋白质测定：蛋白质含量用考马斯亮蓝G-250法测定[12]；可溶性糖测定：可溶性糖含量用蒽酮比色法测定[12]；游离脯氨酸测定：脯氨酸含量采用茚三酮比色法测定[13]；丙二醛含量的测定：丙二醛含量用硫代巴比妥酸比色法测定[13]；SOD和POD酶活性测定：SOD酶活性用NBT法测定[14]，POD酶活性用愈创木酚法测定[14]。

数据采用Microsoft office Excel 2003和SPSS19.0进行统计与分析。运用皮尔逊法进行LT50与个生理指标变化动态的相关分析。采用系统聚类法对各个砧木的抗寒性进行聚类。

2 结果与分析

2.1 不同低温处理对砧木枝条相对电导率的变化

外渗电导率法目前已是果树抗寒性研究的一种常用方法。同等条件下,电导率越高,则抗寒性越差。低温处理条件下各砧木品种枝条相对电导率的变化见图1, 温度降低对各砧木品种电导率的影响变化模式基本呈S形上升趋势。

各个砧木的相对电导率也随着温度的降低而缓慢增大，在整个降温过程中砧木GM256的电导率最低，其次是SH1，M26砧木的电导率在整个过程中都最大；除砧木GM256和SH1温度在-25 ℃以后相对电导率开始急剧增加外，其他各个砧木的相对电导率都在-15～-30 ℃附近时,相对电导率急剧增大。相对电导率急剧增大,说明枝条组织已受到较严重伤害,膜透性增大, 细胞内电解质大量外渗。

2.2 不同低温处理对矮化砧木枝条丙二醛(MDA)含量的变化

由图2可以看出，各个矮化砧木的 MDA 含量随处理温度的降低都呈现上升趋势。在整个低温处理过程中，M26砧木的MDA含量最高，其次是T337和M9， GM256的MDA含量最小，其次是SH1，而MDA变化率确与MDA含量变化相反；在-35 ℃以后所有砧木枝条中 MDA 含量总体上呈现下滑趋势，这说明植物细胞在温度降低到一定程度已经死亡，植物细胞膜生理机能已经丧失，不再进行生理代谢活动。

图1 不同低温处理对砧木枝条相对电导率的影响Fig.1 Effects of different low temperatures on the relative conductivity of apple rootstocks

图2 不同低温处理对砧木枝条MDA含量的影响Fig.2 Effects of different low temperatures on the MDA of apple rootstocks

2.3 不同低温处理对矮化砧木枝条POD酶活性的变化

如图3所示，POD的活性变化趋势是随温度的降低而增强，当温度降到一定程度POD酶活开始下降，在整个降温过程中呈现先升高后降低的趋势。GM256和SH1砧木枝条的POD酶活性从0～-30 ℃直线上升，-30 ℃POD酶活达到最大，-30 ℃以后POD酶活开始下降，其他砧木温度降到-25 ℃以后POD酶活就开始下降，在整个低温处理过程中，GM256和SH1砧木POD酶活性显著高于其他砧木，M26砧木的POD活性最低，其次是M9和T337。

2.4 不同低温处理对矮化砧木枝条SOD酶活性的变化

如图4所示，SOD酶活性的变化趋势和POD酶活性变化趋势一直，也是随温度的降低SOD酶活性呈现想增大后降低的变化趋势；各个砧木在不同低温处理下，SOD酶活性变化一致，砧木GM256和SH1的SOD活性显著高于其他砧木，且温度降到-30 ℃以后酶活开始下降，而其他砧木温度在-20～-25 ℃附近SOD酶活就开始下降。这说明GM256砧木的抗寒性要强于其它处理。

图3 不同低温处理对砧木枝条POD酶活性的影响Fig.3 Effects of different low temperatures on the POD of apple rootstocks

图4 不同低温处理对砧木枝条SOD酶活性的影响Fig.4 Effects of different low temperatures on the SOD of apple rootstocks

2.5 不同低温处理对矮化砧木枝条可溶性蛋白质含量的变化

如图5所示，各个砧木枝条的可溶性蛋白含量随温度的降低而呈现直线上升的趋势，在整个低温处理过程中，GM256砧木的可溶性蛋白含量显著高于其他砧木，其次是SH1砧木，M26砧木在整个低温处理过程中可溶性蛋白含量最低。

图5 不同低温处理对砧木枝条可溶性蛋白含量的影响Fig.5 Effects of different low temperatures on the soluble protein of apple rootstocks

图6 不同低温处理对砧木枝条游离脯氨酸含量的影响Fig.6 Effects of different low temperatures on the free proline of apple rootstocks

2.6 不同低温处理对矮化砧木枝条游离脯氨酸含量的变化

由图6可以看出，随着温度的降低，各个砧木枝条游离脯氨酸含量呈现不断增大的趋势， 0～-20 ℃附近，GM256砧木游离脯氨酸含量高于其他砧木，但各个砧木之间差异不显著；从-25～-35 ℃范围内，GM256砧木的游离脯氨酸含量显著高于其他砧木，其次是SH1砧木，其他砧木间差异不显著。

2.7 不同低温处理对矮化砧木枝条可溶性糖含量的变化

如图7所示，在整个低温处理过程中各个砧木枝条可溶性糖含量的变化随温度的降低而不断增大，温度从0～-25 ℃各个砧木的可溶性糖含量上升趋势比较缓慢，且各个砧木之间差异不显著；温度降到-25 ℃以后，各个砧木的可溶性糖含量急剧上升，且GM256上升速度显著大于其他砧木，M26砧木上升趋势最小，且从-30 ℃以后，砧木M26和M9的可溶性糖含量有下降的趋势。

2.8 不同低温处理对矮化砧木枝条各个生理生化指标相关性评价

苹果矮化砧木枝条 POD 等酶活性均与砧木的生长势显著相关，通过对试验材料进行各项生理生化指标的测定，并对上面单因素做方差分析综合得出结果(表1)。

M26的电导率和丙二醛最大，半致死温度却最小，GM256的LT50达到了-34.1280 ℃，其次是SH1；砧木GM256枝条的SOD、POD、可溶性蛋白含量、可溶性糖含量以及游离脯氨酸的含量最高，且都达到显著水平，其次是SH1、SH38、SH6，各个生理指标最小的砧木为M26，其次为M9；根据各生理指标和酶活判定不同砧木抗寒性为GM256>SH1>SH6>SH40>SH38>T337>M9>M26。

图7 不同低温处理对砧木枝条可溶性糖含量的影响Fig.7 Effects of different low temperaturse on soluble sugar of apple rootstocks

2.9 不同矮化砧木枝条抗寒指标主成分分析相关矩阵

从表2可以看出,各个砧木抗寒性与相对电解质渗出率及 MDA 含量呈负相关，与相对电解质渗出率存在极显著负相关，与MDA 含量也存在及显著负相关；抗寒性与游离脯氨酸含量、可溶性蛋白质含量、可溶性糖含量、POD和SOD存在极显著的正相关。由于众变量之间存在一定的相关性，使得观测数据所反映的信息存在重叠现象。故在葡萄抗寒鉴定中，不能单独依赖上述某个或某2个指标对葡萄一年生枝抗寒性进行评价,而采用主成分分析,在原始组合中利用新转换组合的较少综合指标,能够较好地反映葡萄的抗寒性。

表1 苹果矮化砧木枝条生理生化指标

注：同列中不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)。

Note：Different capital letters in a column mean significant difference at 0.01 level.

表2 不同矮化砧木枝条抗寒性主成分分析相关矩阵

注：**表示在0.01水平(双侧)上极显著相关；*表示在0.05水平(双侧)上显著相关。

Note: ** mean significant difference at 0.01 level (double side); *means significant difference at 0.05 level (double side).

表3 半致死温度(LT50)与在不同温度下的生理指标相关性分析

注：**表示在0.01水平(双侧)上显著相关；*表示在0.05水平(双侧)上显著相关。

Note: **mean significant difference at 0.01 level (double side); *means significant difference at 0.05 level (double side).

2.10 半致死温度(LT50)与在不同温度下的生理指标相关性分析

对不同矮化砧木在不同温度处理的生理指标与苹果矮化砧低温半致死温度(LT50)做相关性分析，表3显示，LT50与0～-35 ℃的可溶性糖变化量、可溶性蛋白变化量、游离脯氨酸变化量呈正相关，且与可溶性糖变化在0、-30和-35 ℃呈显著正相关；与可溶性蛋白变化在-20和-25 ℃时呈显著正相关；与游离脯氨酸在-20、-30和-35 ℃呈显著正相关，-25 ℃时呈极显著正相关。LT50与丙二醛含量、POD和SOD酶活性在0～-35 ℃呈负相关，且与丙二醛含量变化在0和-35 ℃时呈显著负相关，与POD酶活在0、-15、-30和-35 ℃呈显著负相关；与SOD酶活在-25和-30 ℃呈显著负相关。

2.11 聚类分析

对各个不同矮化中间砧进行抗寒性的系统聚类分析，在相似系数7.0水平上矮化砧木共分为3类，如图 8所示，第1类包括GM256，GM256表现特征为低温半致死温度 LT50最低，说明GM256为供试所有品种中抗寒性最强的。第2类：SH38、SH40、SH1、SH6，该类特征是半致死温度LT50较低，表明其抗寒性次之，低温半致死温度在-28.0288～-26.066 ℃。第 3类：T337、M9和M26，该类别特征为半致死温度LT50最高，在-24.782～-23.187 ℃，表明其抗寒性最差。

1:T337, 2:SH38, 3:SH40, 4:M9, 5:GM256, 6:SH6, 7:M26, 8:SH1 图8 系统聚类图Fig.8 Hierarchical clustering plot

3 结论与讨论

植物抗寒性鉴定方法有田间鉴定法[14]、组织细胞结构观察法[15-16]、生理生化测定法[17-19]和电导法[20-23]等，其中电导法应用得最为广泛。几种抗寒性的测定方法各有优缺点,与其他方法相比测定相对电导率比较简单,而SOD酶的测定比较烦琐, 且 SOD 酶容易失活,在测定过程中对环境和操作步骤要求都特别高,但是在品种间抗寒性相差较小时, SOD 酶活性的测定则更能准确和精确地从生理上反映出某个品种的抗寒性。丙二醛(MDA)含量的测定较SOD 酶活性的测定要简便些。本研究通过对不同砧木枝条的相对电导率以及枝条的各个生理生化指标的测定，将所测砧木的抗寒性分为3个等级：抗寒性较强的砧木为 GM256， 抗寒性居中的砧木为SH40、SH38 、SH1 和 SH6，抗寒性稍差的砧木为T337、M9和M26。本研究结果与李荣富等[14，16]对15种苹果矮化中间砧进行的抗寒性田间鉴定结果“GM256 在所测砧木中抗寒性较强”相一致。

通过本研究的试验结果可以看到，这项研究几种方法确定的抗寒性各有利弊，相比其他方法超氧化物歧化酶(SOD)活性在苹果矮化砧木抗寒性综合评价中起到较为重要的作用，SOD 活性与电导率呈正相关，SOD 含量与可溶性蛋白、可溶性糖、游离脯氨酸含量呈负相关，MDA 含量与 POD 含量呈正相关。7个单项生理生化指标 SOD、POD、可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸、MDA、相对电导率在不同苹果矮化砧木之间差异均达到显著水平(P<0.05)。该试验是在实验室通过人工降温得出的，可能和自然条件有所不同，所以还有待于进一步在实际田间生产中确认。

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ScreeningandContrastofDifferentAppleDwarfedRootstocksHardiness

LI Cui-hong, ZHANG Yong-mao*, FENG Yu-qin, MU Yu-wen, LI Chang-liang, WEI Li-juan

(Institute of Agro-products Storage and Processing,Gansu Acadermy of Agricultural Sciences,Gansu Lanzhou 730070,China)

【Objective】The different apple dwarf rootstock medial lethal temperature relations with cold resistance and its cold resistance level were studied to provide the theoretical basis for the screening of the cold hardiness dwarf rootstock in Gansu province. 【Method】 Taken apple dwarf anvil (M9, SH40, SH38, GM258, T337, M26, SH1, SH6, 1 year born mature branches based anvil ) which were introduced from the domestic and foreign as experimental materials, under the low temperature of -15, -20, -25, -30 and -35 ℃, the cold storage branches in 4 ℃ refrigerator were used as CK, and the root stock conductivity, free proline, soluble sugar, protein, MDA, SOD and POD enzyme activity changes of physiological indexes under different low temperature processing were determined. 【Result】 The stock of hardiness had a very significantly negative correlation with relative electrolyte leakage rate and a significantly negative correlation with the MDA content; The stock of hardiness with free proline content, soluble protein content, soluble sugar content, POD and SOD existed a very significantly positive correlation. 【Conclusion】 By the system clustering analysis, the dwarf stocks at the similarity coefficient of 7.0 level were divided into three categories: Category 1 includes GM256; Category 2 T337,SH38, SH40, SH1, SH6; Category3: M9 and M26.

Dwarfed interstocks; Cold resistance; Evaluation; Contrast

1001-4829(2017)5-1183-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.034

2016-05-13

甘肃省苹果产业科技攻关项目苹果矮化砧穗组合与优质壮苗繁育技术集成研究(gpck2013-1)；甘肃省科技重大专项柱形苹果引种试验及特性研究示范(1309NKDE040-001)

李翠红(1981-)，女，甘肃兰州人，研究实习员，硕士，主要从事果树生理生态研究，E-mail：slc_258@163.com；*为通讯作者：张永茂(1957-)，男，甘肃兰州人，研究员，博士，主要从事果树栽培研究，E-mail：zhangym57@126.com。

S661.1

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(责任编辑 陈 虹)