猪不同泌乳期母乳外泌体中let-7a和let-7f的差异表达研究

顾以韧, 梁 艳, 杨雪梅, 陶 璇, 钟志君, 杨跃奎, 曾 凯, 陈晓晖, 吕学斌

(四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

猪不同泌乳期母乳外泌体中let-7a和let-7f的差异表达研究

顾以韧, 梁 艳*, 杨雪梅, 陶 璇, 钟志君, 杨跃奎, 曾 凯, 陈晓晖, 吕学斌**

(四川省畜牧科学研究院，动物遗传育种四川省重点实验室，四川 成都 610066)

【目的】为研究miRNAs在仔猪免疫系统发育过程中的调控作用。【方法】本研究采用荧光定量PCR技术(Q-PCR)研究了不同泌乳期(0、3、7、14、21和28 d)的梅山猪和大约克夏猪母乳外泌体中let-7a和let-7f的差异表达。【结果】let-7a和let-7f在泌乳早期(0～3 d)的表达丰度明显高于泌乳后期(7～28 d)；品种间分析显示梅山猪母乳外泌体中let-7a和let-7f在整个泌乳期(0～28 d)的表达水平均明显高于大约克夏猪。【结论】研究表明，let-7a 和 let-7f能够正向调控仔猪免疫系统发育。本研究可为阐明母乳外泌体包被的miRNA在幼畜免疫系统发育过程中的具体调控机制提供基础数据。

猪; let-7; 母乳; 外泌体

【研究意义】母乳是幼畜的主要营养来源，并含有多种与免疫相关的物质，如免疫球蛋白和乳铁蛋白等，其在幼畜生长和免疫系统发育方面起着至关重要的作用[1-2]。【前人研究进展】miRNA是一类内源性、高度保守、长度在18～25 nt的，并通过结合到靶mRNA上参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA，其参与细胞凋亡和脂肪代谢等多种生物学和病理学过程，并调控免疫细胞的发育[3-4]。Let-7是人类最先发现的miRNA家族，由于在疾病的发生和发展过程中起着重要作用，其被认为是脊椎动物的癌症标记因子[5-6]。外泌体是由细胞衍生的直径约30～100 nm的小囊泡体，其广泛存在于动物的各种体液中，可以保护其中包被的miRNA，mRNA 和蛋白质，还能参与细胞之间信息的传递和遗传物质交换[7-8]。先前研究显示，血清、血浆、唾液和尿液等体液中外泌体包被的miRNA与不同的生理和病理状态密切相关[9-11]，而人、牛和猪母乳外泌体包被的miRNA对新生儿免疫系统的发育具有重要调控功能[10,12-13]。【本研究切入点】本研究采用q-PCR技术对梅山猪和大约克夏猪不同泌乳阶段(0、3、7、14、21和28 d)母乳外泌体中let-7a和let-7f的发育表达模式进行了系统研究。【拟解决的关键问题】以期阐明母乳外泌体中let-7a和let-7f在仔猪免疫系统建立过程中的调控机制。该研究将为探明外泌体包被的miRNA在免疫系统发育过程中的具体调控机制提供基础数据，并有助于进一步阐明乳质量形成的分子机制。

表1 引物信息

注：5S, 18S和U6 snRNA为内参基因。

Note：5Sribosomal RNA, 18Sribosomal RNA, andU6 snRNA were used as endogenous control genes.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验猪只采用健康状况良好的，分娩期相近的经产梅山母猪和大约克夏母猪各3头，所有猪只均由四川省畜牧科学研究院科研实验猪场提供。

1.2 样本采集

在母猪分娩后的0(1 h内)、3、7、14、21和28 d分别采集实验所需的猪乳样本各2管(每管3～5 mL)，并保存在液氮中用于后续实验。

1.3 免疫球蛋白含量的ELISA检测

不同泌乳期的母乳样本中IgA, IgG和IgM水平采用ELISA商业试剂盒(R&D Systems, USA)由上海恒远生物科技有限公司检测完成。

1.4 荧光定量PCR

1.4.1 外泌体中RNA提取 取母乳1.5 mL用2000 r/min离心10 min除去乳中的脂肪球，对上清液再次12 000 r/min离心30 min，并通过0.45 μm PVDF过滤去除细胞碎屑。吸取1 mL上清液加入500 μl ExoQuick Exosome Precipitation Solution (SBI, CA, USA)在4 条件下孵育12 h。将混合液以1500 r/min 离心30 min 获得外泌体沉淀，将沉淀溶于250 μl nuclease-free水中。采用TRIzol-LS (Invitrogen, CA, USA)根据操作说明抽提外泌体中RNA，并通过Agilent Bioanalyzer 2100 和RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA)对抽提的RNA进行质检。

1.4.2 QRT-PCR 采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, China)根据操作说明将等量RNA转录成cDNA，采用SsoFast EvaGreen Supermix Kit (Bio-Rad, USA) 在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad，USA)仪器上进行荧光定量检测。每个反应体系20 μl，由10 μl SsoFast EvaGreen 混合液, 2 μl cDNA, 1 μl上下游引物和7 μl RNA-free water (Ambion, USA) 组成。5S、18S和U6作为miRNA定量的内参基因，引物信息见表1。所有目的miRNA定量结果均通过溶解曲线分析验证PCR产物的特异性，确保产物无引物二聚体，每个样本重复3次。采用2-ΔΔCt法计算目的miRNA的相对表达量。

1.5 统计方法

实验数据采用Sigmaplot12.0对性状指标和基因表达量进行ANOVA和T-test分析，相关性采用Pearson Correlation程序分析。

2 结果与分析

本研究采用ELISA 方法测定了2个猪种不同泌乳阶段母乳中IgA, IgG和 IgM含量， 如图1所示，两猪种的母乳中富含IgA, IgG和 IgM，且发育模式相似，整体趋势均表现为随泌乳时间的增加而下降，且含量在3～7 d时均呈极显著下降(P<0.01)，表明免疫球蛋白在幼畜早期免疫系统建立过程中起着更重要的作用。品种间比较显示，梅山猪母猪中3种免疫球蛋白含量在整个泌乳阶段均显著或极显著高于大约克夏猪 (P<0.01 或P<0.05)，这和我国地方猪种梅山猪的抗病能力强于引进猪种大约克夏猪的种质特性相一致[14]。

本研究采用Q-PCR技术对不同泌乳期母乳外泌体中let-7a和let-7f的发育性表达模式进行了研究，结果显示，let-7a和let-7f在两猪种母乳外泌体中的发育表达模式呈现明显的泌乳阶段特异性(图2)，均表现为在泌乳前期(0～3 d)的表达量极显著高于泌乳后期(7, 14, 21和28 d) (P<0.01)，其表达模式与母乳中免疫球蛋白水平的发育性变化模式一致。品种间比较显示，整个泌乳期(0～28 d)let-7a 和 let-7f在母乳外泌体中的表达水平均表现为梅山猪高于大约克夏猪(let-7a:P0,3,7,14 d<0.01,P28 d<0.05;let-7f:P0 d<0.05,P3,7,14,21,28 d<0.01)。与之相对应的是梅山猪母乳中免疫球蛋白水平(IgA, IgG和IgM)也显著或极显著高于大约克夏猪。相关性分析显示，let-7a 和let-7f在两猪种母乳外泌体中的表达水平与免疫球蛋白含量均呈极显著的正相关(rlet-7a>0.86,P<0.01)。

*和**分别表示同一泌乳阶段不同品种间差异达显著水平(P<0.05)或极显著水平(P<0.01)；同一品种不同泌乳阶段间字母相同者表示差异不显著, 字母不同者表示差异达显著水平(P<0.05)(小写字母)或极显著水平(P<0.01)(大写字母)* P<0.05, ** P<0.01 between breeds at the same age. Different letters indicate a significant difference at P<0.05 (lowercase letter) or P<0.01 (capital letter) levels between days of the same breed图1 两猪种不同泌乳阶段免疫球蛋白含量差异Fig.1 Immunoglobulin differences between pig breeds and age of pigs

图2 let-7a(A) 和let-7f(B) 在不同猪种母乳外泌体中发育性表达模式Fig.2 Breed- and day-specific expression patterns of let-7a(A) and let-7f(B)

3 讨 论

先前研究表明let-7a能调控炎症相关诱导因子IL-6的信号传导，并激活SAT3信号通路[15]；let-7f可通过靶基因A20调控机体对结核病(Mtb)的抵抗能力，并通过影响体内肿瘤坏死因子和IL-1β的含量，调控机体的免疫能力[16]。此外，let-7a和let-7f还具有调控体内B细胞和T细胞分化和影响其活性的功能，进而影响机体的免疫能力[17-18]，而母乳外泌体中的miRNAs可通过消化道进入幼畜体内发挥其对机体的免疫调控作用。本研究中不同猪种母乳中免疫球蛋白(IgA, IgG和 IgM)含量与let-7a和let-7f的表达变化呈极显著的正相关，暗示let-7a和let-7f可影响乳质量的形成，其在外泌体的保护下进入幼畜体内，作用于靶mRNA，发挥其在新生幼畜机体免疫系统建立和完善过程中的正向调控作用。母乳外泌体中let-7a和let-7f表达水平在梅山猪整个泌乳期均高于大约克夏猪，表明梅山猪新生幼畜能够在母乳中miRNAs的调控下更快建立起完善的机体免疫系统，这可能也是梅山猪的抗病能力强于大约克夏猪的重要原因之一。母乳外泌体中let-7a和let-7f的发育性表达模式表明初乳在初生仔猪免疫系统的建立和完善过程中比常乳起着更加重要的作用，常乳更主要作用是提供仔猪机体生长发育所需的营养物质。值得注意的是本研究中的miRNAs和免疫球蛋白水平在大约克夏猪泌乳期21 d时均出现轻微上升，推测可能是由于仔猪断奶应急引起的。鉴于外泌体中miRNA对机体免疫系统的发育和完善具有重要的调控功能，有必要对其具体调控机制进行系统深入的研究。

4 结 论

本研究表明let-7a和let-7f能够正向调控仔猪免疫系统发育，其在梅山猪母乳外泌体中的高表达能够增强仔猪对疾病的抵抗能力。本研究结果可为阐明乳质量形成的分子基础提供基础数据，并为畜牧业中的抗病育种研究提供新的研究思路。

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ExpressionChangesofmicroRNAslet-7aandlet-7finPigMilkExosomesduringDifferentLactationPeriods

GU Yi-ren, LIANG Yan*, YANG Xue-mei, TAO Xuan, ZHONG Zhi-jun, YANG Yue-kui, ZENG Kai, CHEN Xiao-hui, LV Xue-bin**

(Sichuan Animal Science Academy, Sichuan Chengdu 610066, China)

【Objective】It is of great interest to understand the mechanism underlying breast milk quality for immune disease research.【Method】The expression changes oflet-7aandlet-7fmiRNAs were analyzed in porcine milk exosomes across the entire lactation period (newborn to 28 days after birth) by quantitative real-time PCR. 【Result】let-7aandlet-7fwere more abundant in the early lactation period (0 and 3days) than in the later lactation period (7, 14, 21 and 28 days), and were expressed at higher levels in Meishan pigs compared with Yorkshire pigs throughout the entire lactation period. 【Conclusion】This study is a preludetoin-depth investigations of the essential roles of breast milk exosome-packaged miRNAs in the development of the infant’s immune system.

Pig; let-7; miRNA; Milk; Exosomes

1001-4829(2017)5-1218-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.040

2016-06-15

国家自然科学基金(31301942)；四川省畜牧科学研究院基本科研业务费(SASA2014A08；SASA2015A01)；四川省科技支撑计划(2014NZ0092)

顾以韧(1980-)，男，江苏响水人，博士，研究方向为猪遗传育种，*为共同第一作者，**为通讯作者：吕学斌，E-mail: guyiren1128@163.com。

S828

A

(责任编辑 李 洁)