青稞褐变籽粒中寄藏真菌多样性及其致病性分析

潘 虎，达娃卓玛，次 顿，王秋玲，李 颖，白军平

(西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，西藏 拉萨 850032)

青稞褐变籽粒中寄藏真菌多样性及其致病性分析

潘 虎，达娃卓玛，次 顿，王秋玲，李 颖，白军平

(西藏自治区农牧科学院农业质量标准与检测研究所，西藏 拉萨 850032)

【目的】研究青稞褐变籽粒中寄藏真菌的致病性。【方法】采用平板分离藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22等4个青稞品种中的寄藏真菌，同时采用孢子悬浮液回接方法对分离真菌进行青稞籽粒致病性分析。【结果】从4个品种的青稞籽粒中共分离得到86株真菌，真菌ITS区测序表明：寄藏真菌分属于13属19种，同时编号为22-1的菌株同源性仅为89 %，可能是一类真菌新种。对20种寄藏真菌进行青稞种子致病性分析表明：根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)、镰刀属真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉属真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉属真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉属(Aspergillussp. 85-7)和未知种属真菌(Endophytic fungi 22-1)等6类真菌能够显著降低青稞种子的发芽率，同时可引起种子褐变及腐烂，是青稞籽粒中寄藏的主要致病真菌类型。【结论】青稞褐变籽粒中存在多种致病能力较强的寄藏真菌。

寄藏真菌；褐变；藏青2000；藏青320；藏青85；喜拉22

【研究意义】青稞(HordeumvulgareL. var.nudumHook. f. ) 又称裸大麦，是青藏高原地区重要的粮食作物，西藏青稞种植面积约占全国的57 %，年产量约100万吨[1]。青稞富含β-葡聚糖和“生育三烯酚”，具有提高免疫力和抗肿瘤等作用[2]，越来越多的受到全世界的广泛关注。但落后的小农生产方式和简陋的储存条件导致西藏地区青稞籽粒中真菌污染较为严重，寄藏真菌主要引起青稞籽粒发生褐变，可降低种子发芽率和导致种苗丧失活力等，严重影响青稞品质；同时，部分寄藏真菌产生的毒素可导致大骨节病、克山病、癌症等重大疾病[3]，严重影响青稞质量安全和西藏人民的身体健康。【前人研究进展】目前，有关青稞内生真菌的研究较少，仅2007年龚弘强等[4-5]对拉萨市尼木县和林周县青稞籽粒内生真菌区系研究后指出Cladosporium、Alternaria和Phoma是优势种群，同时首次报道了从西藏地区青稞籽粒中分离得到燕麦镰孢(Fusariumavenaceum)，该菌产生的毒素可引起癌症、大骨节病、克山病等人类疾病。【本研究切入点】本研究对采集于西藏拉萨市尼木县褐变青稞籽粒中的寄藏真菌进行了分离和鉴定，同时探讨了寄藏真菌对青稞籽粒的致病性影响。【拟解决的关键问题】明确青稞褐变籽粒中寄藏真菌的种类及其致病能力强弱，为防治由寄藏真菌引起的青稞病害提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

青稞籽粒采集于2015年6月，为农户家储藏的去年产青稞籽粒，采集品种为藏青2000、藏青320、藏青85和喜拉22，采集地点为拉萨市尼木县尼木乡日错村、东嘎村和尼荣村一组，每个村采集4个品种的青稞籽粒各1份，共采集青稞籽粒样品12份。采集的青稞籽粒用无菌塑料袋包装后 - 20 ℃ 保存备用 。

1.2 方法

1.2.1 寄藏真菌的分离筛选[6]将3个地点的同一品种青稞籽粒样品充分混合，随机选取50粒发生褐变的青稞籽粒，用5 %的NaClO溶液侵泡种子3 min，无菌水冲洗3次，用无菌刀将籽粒纵切为2半，将纵切籽粒均匀放置于PDA培养基上，每皿摆放5颗籽粒。28 ℃黑暗培养7 d后，观察并详细记载长出真菌菌落的麦粒数和菌落数，对分离得到的真菌进行纯化并在PDA斜面培养基上4 ℃保藏备用。

1.2.2 寄藏真菌的鉴定 ①形态学鉴定：真菌形态学鉴定参考《真菌鉴定手册》[7]；②分子生物学鉴定：纯培养物真菌使用TIANGEN公司真菌基因组抽提试剂盒提取总 DNA，然后用于目的基因的扩增。真菌PCR扩增采用通用引物 ITS1/ITS4[8]。扩增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 30 个循环；72 ℃ 10 min。取 2 μl PCR 产物， 1 % 琼脂糖电泳进行产物检测。扩增产物送交北京亿明复兴生物科技有限公司测序，利用 BLAST 软件将测定得到的基因序列与NCBI 数据库进行序列比对分析，获取相近菌株的ITS区基因序列，然后用 CLUSTAL X 软件进行全序列比对，利用 MEGA 3.0中的邻接法(Neighbor-Joining)建立目的基因的系统发育树[9]。

1.2.3 寄藏真菌对青稞籽粒的致病性[10]将分离纯化得到的真菌菌株在(25±2)℃ 12 h NUV光照12 h，黑暗交替条件下PDA平板培养7 d，然后分别配制成1×106个/mL孢子悬浮液备用。随机挑选青稞健康籽粒50粒，经1 %的NaClO溶液表面消毒干燥后，在无菌条件下用2 mL孢子悬浮液接种24 h，重复3次，并设置无菌水为对照。将接种过孢子悬浮液的种子等距离放置于培养皿中(皿中置3层湿滤纸)，每天在25 ℃光照8h，15 ℃黑暗16h条件下培养7 d，观测种子发芽率，培养28 d后记录青稞种子褐变率和腐烂率。

2 结果与分析

2.1 青稞籽粒寄藏真菌的物种多样性

从4个青稞品种籽粒中共分离得到86株真菌，其中藏青2000分离得到25株真菌，藏青320分离得到26株真菌，藏青85分离得到23株真菌，喜拉22分离得到12株真菌。通过形态学初步鉴定后选取34株真菌进行分子生物学鉴定，真菌ITS区测序结果表明：34株真菌分属于13属19种，分别为链格孢属(Alternaria)、曲霉属(Aspergillus)、微座孢属(Microdochium)、镰刀菌属(Fusarium)、赤霉属(Gibberella)、青霉属(Penicillium)、毛壳菌属(Chaetomium)、附球霉属(Epicoccum)、单端孢霉属(Trichothecium)、根霉属(Rhizopus)、射脉菌属(Phlebia)、节菱孢属(Arthrinium)和毛霉属(Mucor)；同时有代表编号为22-1的菌株同源性仅为89 %，可能是一类真菌新种(表1)。青稞籽粒寄藏真菌物种多样性较为丰富，但不同品种青稞籽粒中寄藏真菌种属存在较大差异。

2.2 寄藏真菌对青稞籽粒的致病性分析

对经过鉴定的20种寄藏真菌进行青稞种子发芽率、褐变率和腐烂率等致病性分析表明：根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)、镰刀属真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉属真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉属真菌(Epicoccumsp.320-9)、曲霉属(Aspergillussp. 85-7)和未知属真菌(Endophytic fungi 22-1)等6类真菌能够显著降低青稞种子的发芽率，同时可引起种子褐变及腐烂，是青稞籽粒中的主要致病真菌类型，其中根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)可导致所有供试青稞主籽粒几乎不萌发、籽粒褐变率达到70 %～80 %、腐烂率高达95 %以上，有待对根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)进行更深入的研究(表2)。青稞籽粒中6种主要致病真菌有4种分离自藏青2000，有4种分离自藏青320，有1种分离自藏青85，有2种分离自喜拉22，其中根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)分离自藏青2000和藏青320，藏青2000是由藏青320与拉萨白青稞杂交的F1代和喜拉19与昆仑164杂交的F1代复合杂交选育的[11]，可能寄藏真菌在青稞籽粒中有一定的种传性。藏青2000和藏青320作为西藏推广面积较大的青稞品种，关系着西藏的粮食安全及人民的身体健康，然而其籽粒中寄藏真菌种类较多、致病性较强，同时还具有一定的种传性，严重影响西藏地区的青稞质量安全，对藏青2000和藏青320籽粒中的寄藏真菌有待进一步加强防控措施研究。

表1 青稞籽粒中寄藏真菌的初步鉴定

表2 寄藏真菌对青稞籽粒发芽率、褐变率和腐烂率的影响

续表2 Continued table 2

菌株编号发芽率(%)褐变率(%)腐烂率(%)藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉22藏青2000藏青320藏青85喜拉2285-495.095.090.095.05.05.05.05.00.00.00.050.085-5100.085.090.095.00.050.050.00.050.00.00.00.085-6100.095.085.095.00.00.00.050.00.00.10.50.185-710.035.035.030.05.010.015.010.015.010.012.512.522-145.035.070.065.00.00.00.00.010.015.015.010.022-590.090.085.090.00.050.050.10.10.00.00.00.022-895.097.597.595.05.010.010.05.07.57.55.05.0

3 讨 论

青稞是西藏地区的重要粮食作物，青稞的产量和品质直接关系着西藏地区的经济发展和社会稳定。西藏地区传统的青稞收获方式使青稞从收割到入库储藏可在田间持续露晒一个多月，而西藏大部分产粮区温度在10～27 ℃，非常容易导致病菌滋生。寄藏真菌容易导致青稞籽粒发生褐变，严重的可降低种子发芽率及产生真菌毒素，危害人畜安全。本文研究表明拉萨市尼木县4个品种的青稞籽粒中寄藏真菌物种多样性较为丰富，但不同品种青稞籽粒中寄藏真菌种属存在较大差异，同时与内地传统麦类作物籽粒以Aspergillus、Penicillium、Alternaria和Fusarium等为主的优势菌群相比有一定差异[12-13]，这可能与青稞高寒生长环境及较长的生长周期有关。目前，有关青稞内生真菌的研究较少，龚弘强等从西藏地区青稞籽粒中分离得到燕麦镰孢(Fusariumavenaceum)，该菌产生的毒素可引起癌症、大骨节病 、克山病等人类疾病，需要重点研究与防控。本文也从藏青2000和喜拉22 2个青稞品种中分离得到镰刀属真菌(Fusariumsp.)，同时对该属真菌的致病性研究表明其对青稞种子具有较强的致病性，针对该属真菌的致病机理及其防控措施有待进一步研究。

4 结 论

青稞褐变籽粒中存在较高的真菌多样性，根霉属真菌(Rhizopussp. 2000-4)、镰刀属真菌(Fusariumsp. 2000-5)、赤霉属真菌(Gibberellasp. 2000-7)、附球霉属真菌(Epicoccumsp. 320-9)、曲霉属(Aspergillussp.85-7)和未知种属真菌(Endophytic fungi 22-1)等6类真菌是青稞褐变籽粒中寄藏的主要致病真菌类型。

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Seed-borneFungiDiversityofBrowningHullessbarleyandItsPathogenicityAnalysis

PAN Hu， Da-wa Zhuoma， CI Dun， WANG Qiu-ling， LI Ying， BAI Jun-ping

(Institute of Agricultural Product Quality Standard and Testing Research, Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Tibet Lhasa 850032,China)

【Objective】The pathogenicity of seed-borne funji isolated from browning hullessbarley were studied. 【Method】The seed-borne fungi were isolated from Zangqing No.2000, Zangqing No.320, Zangqing No.85 and Xila 22 using plate separation method. Meamwhile, the spore suspensions of the isolated fungi were inoculated to the hullessbarley seeds in order to find out the pathogenicity. 【Result】86 isolated fungi strains were belong to 13 genera 19 species, while the strain named 22-1 with only 89 % homology may be was a new genera of fungi.Rhizopussp. 2000-4,Fusariumsp. 2000-5,Gibberellasp. 2000-7,Epicoccumsp. 320-9,Aspergillussp. 85-7 and Endophytic fungi 22-1 were the main pathogenic fungi which can significantly reduced the genmination rate of hullessbarley seeds, caused seeds browning and decay.【Conclusion】There are many kinds of pathogenic ability seed-borne funji existed in the Browning Hullessbarley.

Seed-borne fungi; Browning; Zangqing No.2000; Zangqing No.320 ; Zangqing No.85 ;Xila No.22

1001-4829(2017)5-1078-04

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.016

2016-06-23

西藏自治区自然科学基金(14-35)

潘 虎(1986-)，男，陕西汉中人，硕士，助理研究员，主要从事农产品质量安全研究工作，Tel：0981-6863726，E-mail：ph2032007@126.com。

S435.123

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(责任编辑 李 洁)