1696例孕妇无创DNA产前筛查结果分析

刘俊娇 郑天生 崔凤姬 于 鹏 许佳琦 郑云静

内蒙古自治区计划生育科学技术研究所(赤峰，024000)

1696例孕妇无创DNA产前筛查结果分析

刘俊娇 郑天生 崔凤姬 于 鹏 许佳琦 郑云静

内蒙古自治区计划生育科学技术研究所(赤峰，024000)

染色体异常是缺陷儿出生的主要原因[1]， 尚无有效的治疗方法， 通过胎儿染色体异常的筛查及诊断， 及时采取措施成为杜绝此类患儿出生的目前唯一途径[2]。目前针对染色体疾病的产前检测主要以血清学筛查技术、有创产前诊断技术(羊水穿刺、脐血穿刺、绒毛活检等)为主。但血清学筛查准确度低， 存在较高的假阳性率(5%)和较高的漏诊率(20%～40%)。 有创产前诊断技术(羊水穿刺、脐血穿刺、绒毛活检等)染色体核型分析产前诊断准确率高，为临床的金标准[3]。但有胎儿畸形、流产、宫内感染等风险，不便于大规模的产前检测。因此如何进行安全的、快速、准确、无创的产前筛查和诊断成为产科临床实际问题。 本文通过本所接受无创DNA产前筛查结果进行回顾性分析， 探讨无创DNA产前筛查技术对检测胎儿染色体非整倍体疾病的准确性。

1 资料与方法

1.1临床资料

2015年11月1日-2016年11月30日在本所接受无创DNA产前筛查者1696例妇女作为研究对象， 均为单胎自然妊娠孕妇， 孕12～24周。 按孕妇年龄及血清学筛查结果分为3组：年龄高危组， 822例， 年龄≥35岁。血清学筛查高危组，392例， 年龄<35岁， 血清学筛查提示21-三体高风险314例， 21-三体临界高风险68例， 18-三体高风险8例， 18-三体临界高风险2例。 其他原因组， 482例，将其继续分为3亚组，A组：年龄<35岁， 未做血清筛查或血清学筛查低风险， 要求检测无创DNA者 共354例； B组，年龄<35岁， 超声结果异常， 共60例； C组，既往有不良孕产史，共68例。

1.2方法

门诊医生告知孕妇及家属筛查方法的利弊及风险， 所有孕妇签署知情同意书后取血液样本。 利用半导体测序法进行胎儿染色体非整倍体21-三体、18-三体和13-三体检测。本研究经所伦理委员会审查。

1.2.1样本采集﹑血浆的分离无菌抽取孕妇外周静脉血8ml，利用EDTA作为抗凝剂进行抗凝血处理，采血后4h内进行实验处理。 1600g 室温离心 10 min，将上清液移至新的离心管中， 再经1600g 室温离心 10min 后，将上清液移至新的离心管中，获得血浆，每例血浆分为4份，每份1ml。直接用于后续实验或-20℃保存。

1.2.2 DNA提取﹑文库构建﹑上机测序用DNA提取试剂盒(达安基因)，根据核酸提取试剂盒DAAN GENE(磁珠法)说明书要求， 通过加大反应体系(3倍反应体系)，提取 600μl血浆游离DNA, 得30μl的DNA溶液。 DNA可置于-20℃保存， 保存时间不超过1年， 冻融次数不超过8次。 用文库构建试剂盒(达安基因)构建DNA文库。将建好的文库样品通过荧光定量PCR仪进行文库定量。 上机测序通过模板制备和模板富集， 利用第2代测序仪DA8600进行上样和测序。

1.2.3筛查结果主要通过分析获得每条染色体上筛查到碱基占所有筛查到的碱基的百分比，并计算该值与参考数据库中正常样本碱基的百分之间的偏差即Z值， 确定胎儿的21、18和13号染色体是否异常。 若检测样本中的21、18和13号染色体中的一个染色体Z值>3， 则提示该样本存在染色体异常， 患有相应染色体疾病， 需要进行进一步的临床诊断确认， 确诊方式主要是羊水穿刺。Z值<3则低风险，低风险孕妇被告知按常规产检方案并电话随访胎儿出生情况。

2 结果

2.1无创DNA产前筛查

1696例无创DNA产前筛查，高风险共31例，其中21-三体高风险22例，18-三体高风险6例，13-三体高风险3例； 不同年龄高危组， 血清学高危组， 其他组的产前筛查异常情况见表1。

表1 1696例孕妇无创DNA产前筛查异常情况

2.2孕妇无创DNA产前筛查高风险与羊水细胞染色体核型分析结果比较

产前筛查高风险31例中26例孕妇进行羊水细胞染色体核型分析。 22例21-三体高风险者中20例进行了羊水穿刺(19例结果为阳性、1例结果为阴性)， 2例直接引产，经随访得知胎儿均有多处畸形，家属拒绝送病理。 6例18-三体高风险者中4例进行了羊水穿刺(3例证实为阳性、1例为阴性继续妊娠)，2例直接引产，经随访得知胎儿均有多处畸形，家属拒绝送病理。 3例13-三体高风险者中2例进行了羊水穿刺(1例结果为阳性， 1例结果为阴性)， 1例胎死宫内，家属拒绝送病理，因直接引产和胎死宫内的胎儿家属拒绝做病理，所以无法确定是否有染色体非整倍体疾病，故计算阳性预测值时未纳入。26例无创DNA筛查提示高风险者的羊水穿刺情况见表2。经分析， 无创DNA产前筛查对常见的染色体非整倍体21-三体、18-三体、13-三体的检出率是100%， 准确率是88.5%， 假阳性率是0.18%， 假阴性率是0。

表2 无创DNA产前筛查高风险与羊水细胞染色体核型分析结果比较

*2例直接引产#1例胎死宫内△26例行羊水穿刺

2.3无创DNA产前检查测结果阴性孕妇随访

电话随访3组无创DNA筛查低风险孕妇的妊娠结局，截止至2016年12月1日已出生的新生儿经检查均未发现染色体非整倍疾病(21-三体、18-三体、13三体)。

3 讨论

我国是出生缺陷儿的高发国家，染色体异常是最常见的原因[4]。主要通过产前筛查与产前诊断进行控制。目前有创的羊水细胞染色体核型分析是产前诊断的金标准，但该方法具有一定的风险，因此降低了产前诊断的依从性[5]。故只能针对产前筛查高危人群进行。传统的血清学筛查及超声检查来评估胎儿染色体异常的方法的准确率及敏感度不够，假阳性率较高。故需要一种安全、可靠的产前筛查和产前诊断方法进行产前干预。长期以来很多研究者一直在寻找一种无创且高效的方法进行产前筛查及诊断来控制缺陷儿的出生。1997年Lo等首次发现母体外周血中存在胎儿游离DNA片段[6]。 随着近几年新一代测序技术即大规模平行测序技术的广泛推广，且经过了大量临床实验的基础上无创DNA产前筛查技术成为产前筛查的新模式，并在世界范围内进行临床推广[7-8]。

据报道2010年因年龄因素做产前筛查及诊断的孕妇比例已高达46.20%[9]，随着我国生育政策的变化，赤峰地区高龄孕妇的比例逐渐上升。本研究结果显示：无创DNA产前检测对常见的染色体非整倍体21-三体、18-三体、13-三体的检出率为100%，准确率是88.5%， 假阳性率是0.18%，假阴性率是0，远远高于传统的血清学筛查。所以赤峰地区参与无创DNA筛查人数逐渐上升，血清学高风险孕妇、临界高风险孕妇、高龄孕妇、不符合血清学筛查的孕妇等是选择无创DNA产前筛查的主要人群。从本结果可见，高龄孕妇所占比例近50%，且无创DNA产前筛查染色体非整倍体疾病阳性比例高，所以属年龄高危人群更要重视产前DNA筛查。

本资料中1696例无创DNA产前筛查中发现31例高风险者， 其中4例直接引产， 1例胎死宫内， 26例接受羊水穿刺。 经分析结果表明，无创DNA产前筛查对21-三体和18-三体的检出率均为100%、准确率达95%和75%，13-三体准确率偏低(50%)可能与本批次13-三体的检出例数较少有关。如何进一步提高13-三体筛查的准确率是我们下一步研究的方向。 有文献报道， 无创DNA产前筛查的检出率(100%)高于血清学筛查检出率(60%)， 并且准确率高，可作为有创产前诊断技术(羊水穿刺、脐血穿刺、绒毛活检等)的有效辅助检查[10]。 本资料结果显示无创DNA产前筛查的假阳性率较低， 仍然需要进行羊水细胞染色体核型分析来辅助明确诊断。

综上所述， 无创DNA产前筛查对21-三体、18-三体、13-三体具有较高的敏感性并与羊水穿刺结果符合率高， 具有快速、无创、准确率高等优点， 所以广泛应用于产前染色体非整倍体疾病的筛查。 但存在假阳性和一定的局限性， 因此无创DNA产前筛查只能作为一项“近似诊断的筛查”，不能完全代替羊水细胞染色体核型分析。

[1] 边旭明.胎儿染色体非整倍体的无创DNA产前检测.实用妇产科杂志，2013,29(5):330-333.

[2] 虞斌，张玢，史华,等.唐氏综合症胎儿、新生儿及其孕母血清铜蓝蛋白的表达特点[J].中华围产杂志，2011,14(12)：720.

[3] Wang JY，Zhen DK，Zilberstein ME，et al.Non-invasive exclusion offetal aneuploidy in at-risk couple with a balanced translocation[J].Mol Hum Reprod,2000,6(2):103-106.

[4] Franssen MT，Korevaar JC，Tjoa WM，et a1．Inherited unbalanced structural chromosome abnormalities at prenatal chromosome analysis are rarely ascertained through recurrent miscarriage[J]．Prenat Diagn，2008，28(5)：408-411．

[5] 战芳，吴丹丹.无创DNA产前检测在诊断胎儿染色体非整倍体疾病中的应用[J].中国优生与遗传杂志，2014,22(11)：46-50.

[6] Lo YM，Corbetta N，ChamberIain PF，et al．Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum[J]．Lancet，1997，350(9079)：485-487.

[7] Chiu RW，Chan KC，Gao Y，et a1．Noninvasive prenatal diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy by massively parallel genomic sequencing of DNA in maternal plasma[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：20458-20463.

[8] 王玉兰，陶华娟等.346例孕妇无创DNA产前检测结果分析[J].中国优生与遗传杂志，2014,22(6)：62-63.

[9] 窦淋淋，郭远瑜等.无创产前基因检测技术的临床应用效果分析[J].中国卫生检验杂志，2016,26(3)：320-372.

[10] 侯巧芳，吴东，楚艳,等，孕妇外周血游离胎儿DNA检测在无创产前诊断中的临床应用[J].中华妇产科杂志，2012,47:813-814.

10.3969/j.issn.1004-8189.2017.07.014

2016-12-07

2017-03-15

[责任编辑：王丽娜]