癌胚抗原黏附分子1对胃癌细胞株AGS生物学特性的影响

朱为民，黄逸姣，潘 棋，陈艳，谢楠岚，浦 勇

（1.无锡市第二中医医院中西医结合肿瘤科，无锡 214000；2.无锡市第四人民医院病理科，无锡 214000）

癌胚抗原黏附分子1对胃癌细胞株AGS生物学特性的影响

朱为民1，黄逸姣1，潘 棋1，陈艳1，谢楠岚1，浦 勇2

（1.无锡市第二中医医院中西医结合肿瘤科，无锡 214000；2.无锡市第四人民医院病理科，无锡 214000）

目的：探讨癌胚抗原黏附分子1对胃癌细胞株AGS生物学特性的影响。方法：将CEACAM1 siRNA转染人胃癌细胞株AGS，再用western-blot检测CEACAM1的表达；流式细胞术、Transwell实验和裸鼠负荷瘤实验分析转染后的AGS细胞的生物学特性变化。结果：转染CEACAM1 siRNA后的AGS细胞几乎不表达CEACAM1。CEACAM1沉默基因对AGS细胞增殖、凋亡和细胞周期无影响。转染CEACAM1 siRNA后的AGS细胞侵袭能力明显降低，荷瘤裸小鼠肿瘤的生长受到抑制。结论：沉默CEACAM1基因的表达能够明显抑制AGS细胞的转移以及活体成瘤性，为胃癌的基因治疗提供理论依据。

胃癌；基因转染；流式细胞术；癌胚抗原黏附分子1

癌胚抗原相关黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1）是一种跨膜糖蛋白，属于癌胚抗原家族，属于免疫球蛋白超家族成员［1］。CEACAM1功能多样，在不同恶性肿瘤中发挥着不同的作用。在前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌及肝癌中扮演着抑癌基因的角色。但在非小细胞肺癌、黑色素瘤乃至胃癌当中，却起着促进肿瘤侵袭、转移的作用。目前CEACAM1的过表达与胃癌发生、发展之间的关系不甚明了，本研究拟通过siRNA抑制CEACAM1的表达，进一步研究CEACAM1的过表达与胃癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期、转移以及裸鼠体内成瘤等之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌细胞株AGS由江南大学附属医院赠送；40只BALB/c裸鼠购自苏州大学实验动物中心。RPMI 1640、胎牛血清购自Gibco公司；兔抗人CEACAM1单克隆抗体购自Abcam公司。

1.2 siRNA干扰实验

将人胃癌细胞株AGS接种于RPMI 1640培养液中，取对数生长期的AGS细胞接种于6孔板；24h后，细胞贴壁，按每孔5μL将CEACAM1 siRNA（100pmol）和Lipofectamine 2000分别加入250μL Opti-MEM I，室温放置，再把CEACAM1siRNA（100pmol）和Lipofectamine 2000混合均匀，室温下孵育25min；孵育好的混合物按每孔500μL的标准加入6孔板中，在37℃，5%饱和湿度条件下继续培养48h。

1.3 CEACAM1蛋白表达的检测

将细胞用0.25%胰酶消化，1500rpm离心5min，PBS洗涤细胞二次，收集细胞；向各细胞中加入150μL的PIPA裂解液，混匀细胞，水浴30min，12000rpm离心20s后以12%聚丙烯酰胺凝胶分离，然后电转至硝酸纤维膜上。用10%FBS/ TBST在4℃封闭过夜后，分别用一抗和二抗温浴1h。最后加发光底物于暗室中充分反应后用胶片曝光20min。最后进行图像扫描分析。（见图1）

图1 CEACAM1蛋白表达

1.4 细胞生长增殖的检测

将对数生长期的AGS细胞接种于96孔板中，每孔约100μL；24h后转染CEACAM1 siRNA；在37℃，5%饱和湿度条件下继续培养7d。每孔加入MTT工作液20μL（5g/L），37℃孵育4h，吸弃上清液，加入100μL DMSO，震荡15min。在酶标仪上测570nm处吸光度（A）值。每组细胞设3个复孔，取平均值。

1.5 细胞凋亡的检测

将对数生长期的AGS细胞接种于6孔板中，转染CEACAM1 siRNA，48h后PBS洗涤细胞一次，收集细胞；用100μL Binding Buffer悬浮细胞，分别加入5μL AnnexinV-FITC和5μL PI，室温避光孵育15min后，用FACSort流式细胞仪分析。实验重复3次，取平均值。

1.6 细胞周期的检测

取6孔板中对数生长期的AGS细胞，转染CEACAM1 siRNA 48h后，加PBS洗一遍，用0.25%胰酶消化，当细胞变圆时，吹打细胞，1000rpm离心5min，收集细胞；加入75%预冷乙醇，于4℃固定过夜；离心收集细胞，用PBS洗涤二遍，加入RNA酶（1g/ L）10μL，PI（10mg/L）溶液10μL，0.5%TritonX-100，室温避光孵育30min，加PBS 400μL，上FACSort流式细胞仪分析。实验重复3次，取平均值。

1.7 Transwell实验

AGS细胞用siRNA处理24h后，Transwell下室内加入含10%小牛血清的RPMI 1640培养液600μL，上室内加入不含血清的RPMI 1640培养液稀释成的1*105/mL的细胞悬液200μL，培养24h后用0.1%结晶紫染色15min，然后于显微镜下计数，各组低倍镜下随机取5个视野计数，比较各组间细胞数的差异。

1.8 裸鼠负荷瘤实验

40只裸鼠随机分为2组，对照组和CEACAM1基因沉默组，每组20只。取对数生长期的AGS细胞，转染CEACAM1 siRNA 48h后，分别用胰酶消化细胞，用PBS液重悬制成2.5*107/mL的单细胞悬液。每只裸鼠于背部靠后肢皮肤处接种0.2ml细胞悬液，用苦味酸做好标记，继续SPF级饲养。观察肿瘤体积和生长速度，实验进行4周后，处死裸鼠，称量体积和瘤重。

1.9 统计分析

采用SPSS19.0统计软件分析，组间比较采用t检验，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA干扰后对CEACAM1蛋白表达的影响

通过Western blot检测转染si RNA后CEACAM1的表达，结果发现胃癌细胞株AGS转染CEACAM1 siRNA后，CEACAM1蛋白几乎不表达，差异显著。

2.2 CEACAM1沉默基因对AGS细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

1周内，CEACAM1基因沉默的AGS细胞较阴性对照组的生长增殖没有明显下降，提示CEACAM1表达降低对AGS细胞株的生长增殖没有明显影响。CEACAM1基因沉默的AGS细胞凋亡与阴性对照组相比，没有明显差异。与阴性对照组相比，CEACAM1基因沉默后的AGS细胞周期分布没有明显改变（见图2）。

图2 CEACAM1沉默基因对AGS细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

2.3 Transwell 细胞侵袭性检测结果

CEACAM1基因沉默后的AGS细胞穿过基底膜的细胞数为（44.3±6.5），明显少于阴性对照组的（74.8±8.5），经t检验，t=12.74，P＜0.01，差异有统计学意义。

2.4 裸鼠负荷瘤实验

所有40只裸鼠在实验过程中均成活。处死裸鼠后肿瘤自裸鼠上剥离下来进行肉眼观察，呈结节状，灰白色，质地硬，表面有假包膜，容易与周围组织剥离。CEACAM1基因沉默组瘤体肿瘤质量（0.66±0.29）g、体积（0.64±0.31）cm2，明显低于对照组的瘤体质量（1.49±0.26）g、体积（1.59±0.34）cm2，经t检验，t值分别为9.53、9.23，P＜0.01，差异有统计学意义。

3 讨论

CEACAM1广泛表达于上皮细胞和血管内皮细胞，通过同嗜性和异嗜性黏附介导细胞间的相互作用，从而参与复杂的生理和病理生理作用，例如细胞的生长、分化、活化、凋亡以及免疫调节、血管淋巴管的生成、血栓形成和肿瘤代谢生长等［2，3］。

CEACAM1在不同肿瘤细胞中的表达不一样，在结直肠癌、肝癌、前列腺癌、膀胱癌中作为抑癌因子表达是下调的［4-7］；而在非小细胞肺癌、恶性黑色素瘤中的表达是上调的［8，9］。既往的研究显示，CEACAM1在胃癌中的表达明显增高，且提示CEACAM1与胃癌的发生、发展关系密切［10，11］。为进一步揭示CEACAM1基因对胃癌细胞生物学行为的影响，笔者通过CEACAM1 siRNA沉默CEACAM1的表达，初步探索CEACAM1的过表达与胃癌细胞的增殖、凋亡、细胞周期、转移以及裸鼠体内成瘤等之间的关系。

笔者发现用CEACAM1 siRNA沉默AGS胃癌细胞株中的CEACAM1基因后，较对照组相比其增殖情况无明显改变；而后采用流式细胞仪检测CEACAM1 siRNA转染AGS后的凋亡及细胞周期情况，显示其凋亡情况和细胞周期无明显改变。提示CEACAM1基因可能不参与调控胃癌细胞的增殖、凋亡和细胞周期。而在黑色素瘤中，CEACAM1通过上调SOX2的表达继而促进黑色素瘤细胞的增殖。在增殖期的肺癌A549细胞中并未检测到CEACAM1的表达，而在产生细胞-细胞接触抑制的细胞表面可检测到其显著表达；在肺癌A549细胞中，高表达的CEACAM1能够明显抑制A549细胞的增殖。这也说明在不同类型的肿瘤细胞中CEACAM1发挥不同的作用。

Transwell细胞侵袭实验中，AGS胃癌细胞株中的CEACAM1被抑制后，其侵袭性明显降低，这说明胃癌细胞中高表达的CEACAM1能够提高其转移能力。在非小细胞肺癌、甲状腺癌和黑色素瘤中也发现高表达的CEACAM1能够提高肿瘤细胞的侵袭、转移能力，而CEACAM1促进肿瘤细胞的侵袭能力可能与其能够促进微血管和毛细淋巴管的生成相关。荷瘤裸小鼠人胃癌模型表明，CEACAM1基因沉默组肿瘤质量、体积明显低于对照组的肿瘤质量、体积。本研究表明，下调CEACAM1的表达能够明显抑制AGS细胞的转移以及活体成瘤性，提示CEACAM1在胃癌的发生、发展中起着重要作用，也为进一步研究CEACAM1基因在胃癌中的作用提供了理论依据。

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The biological characteristic effect of CEACAM1 in the human gastric epithelial cell line AGS

Zhu Wei-min1, Huang Yi-jiao1, Pan Qi1, Chen Yan1, Xie Nan-lan1, Pu Yong2
(1. Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, The Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Wuxi City, Wuxi 214000, China; 2. Department of Pathology, Wuxi Fourth People’s Hospital, Wuxi 214000, China)

ObjectiveTo detect the biological characteristic effect of CEACAM1 in the human gastric epithelial cell line AGS.MethodssiRNA CEACAM1 was transfected into human gastric cancer cell line AGS, and then relative protein content of CEACAM1 was measured by western blot. Effects of CEACAM1 gene silencing in the human gastric epithelial cell line AGS were analyzed, including the changes in rate of growth, apoptosis and cell cycle. The migration was investigated by Transwell chambers. The AGS cells and CEACAM1 gene silencing AGS cells were injected into nude mice respectively, and tumor formation at the sites of injection monitored.ResultsThe AGS cells which was transfected into CEACAM1 siRNA didn’t express CEACAM1. CEACAM1 gene silencing in cell line AGS has no effect on rate of growth, apoptosis and cell cycle. Transfected CEACAM1 siRNA would decrease the invasion capacity of AGS cell line and inhibit the growth of AGS cell line in nude mice.ConclusionTransfection of CEACAM1 inhibited metastasis and tumor formation in the human gastric epithelial cell line AGS. It may be used in gene therapy for gastric cancer.

gastric cancer; gene transfection; flow cytometry; carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1

R735.2

A

1673-016X（2017）05-0013-03

2017-04-20

无锡市卫生局科研项目合同书（NO.MB201403）

浦勇，E-mail：pu776381135@163.com