TWIST1基因敲低对DFOG抑制OVCAR3源性球细胞自我更新和FoxM1表达的影响

董巍檑，宁映霞 ，陈 阿，许 畅，崔迎红，李 翔

（1.南华大学附属第一医院，衡阳 421001；2. 广州医科大学附属第一医院，广州 510120；3. 湖南师范大学医学院，长沙 410006）

TWIST1基因敲低对DFOG抑制OVCAR3源性球细胞自我更新和FoxM1表达的影响

董巍檑1，宁映霞2，陈 阿3，许 畅3，崔迎红3，李 翔3

（1.南华大学附属第一医院，衡阳 421001；2. 广州医科大学附属第一医院，广州 510120；3. 湖南师范大学医学院，长沙 410006）

目的：探讨7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀异黄素通过下调Twist1/FoxM1表达抑制OVCAR3源性球细胞自我更新作用分子机制。方法：表达TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球细胞敲低TWIST1基因表达。肿瘤球形成试验检查细胞自我更新能力。蛋白质印迹法检测细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平。结果：与OVCAR3细胞比较，OVCAR3源性球细胞具有更强自我更新能力以及高水平表达Twist1和FoxM1蛋白。 TWIST1 shRNA有效抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和下调Twist1和FoxM1蛋白表达。TWIST1 shRNA协作DFOG（5 μM）抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和Twist1和FoxM1蛋白表达。结论：DFOG可能通过调控Twist1表达抑制FoxM1表达，进而抑制OVCAR3源性球细胞自我更新。

卵巢癌；卵巢癌干细胞；7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀异黄素；Twist；FoxM1

尽管先前的研究证实：金雀异黄素新型合成类似物7-二氟甲氧基-5，4’-二-正辛烷氧基金雀异黄素（7-difluoromethoxyl-5，4'-di-n-octyl genistein，DFOG）通过下调FoxM1蛋白表达诱导卵巢癌细胞凋亡和抑制卵巢癌干细胞样细胞肿瘤球形成［1-4］。然而，DFOG如何调节FoxM1表达抑制OVCAR3源性球细胞自我更新能力还有待研究。Qian J等［5］的研究建议Twist1上调FoxM1促进胃癌细胞增殖。藉此，本文用表达TWIST1 shRNA腺病毒感染OVCAR3源性球细胞敲低TWIST1基因表达；以期阐释DFOG通过调控Twist1表达抑制OVCAR3源性球细胞自我更新作用分子机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

DFOG（分子量：544，性状：黄色粉末，纯度：98%）参照文献［6］方法合成和结构确证，由湖南师范大学曹建国教授惠赠。对照的pHBAd-U6-GFP质粒包装重组腺病毒由中国汉恒生物技术公司提供；表达TWIST1 shRNA重组腺病毒（汉恒生物技术公司，中国上海市）：根据GenBank数据库提供的TWIST1基因核苷酸序列（NM_000474），设计干扰序列：TWIST1-shRNA（5’to 3’）：atcc-GCTGGACTCCAAGATGGCAAGCTTTTTTTa。病毒滴度：1E+10pfu/mL；规格：2.0 mL。Opti-MEM试剂购自Invitrogen公司（中国上海市）。

1.2 细胞来源与球培养

OVCAR3细胞购自中国科学院细胞中心（中国上海市）。参照文献［7］的方法和步骤，进行细胞培养和肿瘤球培养，取OVCAR3细胞系第2代球细胞用于基因调控和药物干预试验。

1.3 pHBAd-U6-GFP质粒与pHBAd-U6-GFP-shTWIST1质粒包装重组腺病毒感染

取OVCAR3源性球细胞，Accutase酶细胞分离溶液消化。每孔1.0× 105个细胞接种6孔细胞培养板中，培养过夜允许细胞贴壁。细胞生长至融合度为50%时吸弃培养基，每孔1.0 mL PBS洗涤2次，每次5min。每孔加1.0 mL Opti-MEM，冰上，将5.0 μL病毒液溶于Opti-MEM试剂；轻柔混匀。感染病毒2 h，然后更换干细胞培养基，培养48h。

1.4 Western Blot

参照先前发表文献［1-4］的方法和步骤完成蛋白质印迹分析。

1.5 统计学分析

各组实验数据录入SPSS 20.0 for windows evaluation 软件建立数据库，用均数±标准差表示，采用One Way ANOVA方差分析；方差齐性检验，在方差齐性时，多组均数间比较采用LSD法，在方差不齐时，多组均数间采用Tukey's检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 OVCAR3细胞系球细胞不同传代培养次数的球形成率比较

如图1所示，分散的第一代OVCAR3细胞系球细胞能够形成第2代肿瘤球，随后形成第3代和第4代肿瘤球；以第2代球细胞在第3次传代培养得到的肿瘤球体积最大以及肿瘤球形成效率最高（P＜0.05）；肿瘤球传代培养维持超过10代。这些结果说明：人卵巢癌OVCAR3细胞系第2代球细胞具最强自我更新潜能。

2.2 OVCAR3源性球细胞更高表达Twist和FoxM1蛋白

图2示：与OVCAR3细胞相比，OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平增高。

图1 OVCAR3细胞系球细胞不同传代培养次数对肿瘤球形成的影响与第1次球培养相比：*P＜0.05；与第2次和第4次球培养相比：#P＜0.05。数据示3次独立实验的均值±标准差（n=9）。

图2 OVCAR3细胞和OVCAR3源性球细胞Twist及FoxMail蛋白表达的比较OVCAR3：OVCAR3细胞；OCSLC：OVCAR3源性球细胞。

2.3 TWIST1 shRNA抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成

与OVCAR3源性球细胞和表达GFP基因OVCAR3源性球细胞相比，表达TWIST1 shRNA OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成率显著的下降（图3；P＜0.05）。

图3 TWIST1 shRNA对OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成的影响（Mean ±SD，n=3）OCSLC：OVCAR3源性球细胞；GFP：表达GFP基因OVCAR3源性球细胞；TWIST1 sh RNA：表达TWIST1 sh RNAOVCAR3源性球细胞。与OVCAR3源性球细胞比较：*P＜0.05。与表达GFP基因OVCAR3源性球细胞比较：#P＜0.05。

2.4 TWIST1 shRNA沉默TWIST1基因表达和下调FoxM1蛋白表达

与OVCAR3源性球细胞和表达GFP基因OVCAR3源性球细胞相比，表达TWIST1 shRNA OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平平行地下降（图4；P＜0.05）。

图4 TWIST1 shRNA对OVCAR3源性球细胞Twist1和FoxM1蛋白表达的影响OCSLC：OVCAR3源性球细胞；GFP：表达GFP基因OVCAR3源性球细胞；sh RNA：表达TWIST1 shRNAOVCAR3源性球细胞。

2.5 TWIST1 shRNA协作DFOG抑制OVCAR3源性球细胞自我更新

图5示：DFOG（5.0 μmol/L）降低表达GFP基因OVCAR3细胞肿瘤球形成率，TWIST1 shRNA抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成，同时，TWIST1 shRNA协作DFOG（5.0μmol/L）抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成（P＜0.05）。

图5 TWIST1 shRNA、DFOG以及两者合用对OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成率影响TWIST1 shRNA、DFOG（5.0 μmol/L）以及两者合用处理OVCAR3源性球细胞与表达GFP基因OVCAR3源性球细胞比较的统计学分析：*P＜0.05。TWIST1 shRNA转导和TWIST1shRNA加DFOG（5.0 μmol/L）与DFOG（5.0 μmol/L）单独处理OVCAR3源性球细胞比较的统计学分析：# P＜0.05。

2.6 TWIST1 shRNA协作DFOG抑制OVCAR3细胞Twist1和FoxM1蛋白表达

如图3所示，DFOG（5.0 μmol/L）降低表达GFP基因OVCAR3细胞Twist1和FoxM1蛋白表达水平，TWIST1 shRNA平行地下调OVCAR3细胞Twist1和FoxM1白表达，同时，TWIST1 shRNA协作DFOG（5.0μmol/L）抑制OVCAR3细胞Twist1和FoxM1蛋白表达。

图6 TWIST1 shRNA、DFOG以及两者合用对OVCAR3细胞Twist1蛋白表达的影响

3 讨论

已有研究发现Twist过表达与卵巢癌干细胞多药耐药以及肿瘤患者的转移和不良预后有关［8］。Twist是一种高度保守的碱性-螺旋-环-螺旋转录因子，在胚胎发育中促进细胞运动方面起重要作用。尽管大量研究证据表明Twist在肿瘤进程中的重要性［8-12］，但是，Twist对卵巢癌干细胞样细胞自我更新的调节机制仍未得到充分理解。我们的实验结果提供的证据显示，表达TWIST1 shRNA OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成率降低，同时，伴随着Twist1和FoxM1蛋白表达水平平行地下降。Qian J等［5］发表文章指出Twist1上调FoxM1促进胃癌细胞增殖。结合先前研究的发现，即：下调FoxM1能有效地抑制卵巢癌干细胞样细胞自我更新和逆转上皮-间充质转化，我们推测通过调控Twist1基因抑制FoxM1表达可能是一种靶向卵巢癌干细胞样细胞治疗人卵巢癌的有希望的策略。

基于我们先前的研究结果证实，金雀异黄素新型合成类似物DFOG通过下调FoxM1诱导卵巢癌细胞凋亡和抑制卵巢癌干细胞样细胞干性［1-4］，我们接下来观察了TWIST1 shRNA与适中的有效浓度DFOG（5 μM）合并用药的效应。结果证实，TWIST1 shRNA协作DFOG（5 μM）抑制OVCAR3源性球细胞肿瘤球形成和下调Twist1和FoxM1蛋白表达。从而为验证DFOG通过调控Twist1下调FoxM1蛋白表达抑制卵巢癌干细胞样细胞（OVCAR3源性球细胞）自我更新能力的科学假设提供证据。

尽管目前对于Twist基因的调控机制尚未完全阐明，但是，有研究证据表明Twist转录因子的调控可以发生在转录水平［9］、转录后修饰水平［10］、微小RNA调节水平［11］和表观遗传调节水平［12］。因此，阐释金雀异黄素及其类似物如何调节Twist1基因表达和活性的分子机制值得深入研究。

［1］ 宁映霞, 曹建国.7-二氟甲氧基-5, 4'-二正辛烷氧基金雀异黄素对卵巢癌干细胞样细胞自我更新和FoxM1表达的影响［J］. 湖南师范大学学报 (医学版), 2014, (01)： 10-13.

［2］ Ning Y, Li Q, Xiang H, et al. Apoptosis induced by7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein via the inactivation of FoxM1 in ovarian cancer cells［J］. Oncol Rep.2012, 27(6)： 1857-1864.

［3］ Ning Y, Luo C, Ren K, et al. FOXO3a-mediated suppression of the self-renewal capacity of sphere-forming cells derived from the ovarian cancer SKOV3 cell line by 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein［J］. Mol Med Rep.2014, 9(5)： 1982-1988.

［4］ Ning YX, Li QX, Ren KQ, et al.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein inhibits ovarian cancer stem cell characteristics through the downregulation of FOXM1［J］. Oncol Lett.2014, 8(1)： 295-300.

［5］ Qian J, Luo Y, Gu X, et al. Twist1 Promotes Gastric Cancer Cell Proliferation through Up-Regulation of FoxM1［J］. PLoS One.2013, 8(10)：e77625.

［6］ Xiang HL, Liu F, Quan MF, et al.7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-noctyl genisteininhibitsgrowth of gastric cancercells through downregulating forkhead box M1［J］. World J Gastroenterol.2012, 18(33)：4618-4626.

［7］ 李朵, 彭耀金, 陈阿, 等. 白杨素对TNF-α诱导慢性暴露TGF-β卵巢癌OVCAR-3细胞系球形成的影响［J］. 中国药理学通报, 2016, (08)： 1133-1137.

［8］ Nuti SV, Mor G, Li P, et al. TWIST and ovarian cancer stem cells：implications for chemoresistance and metastasis［J］. Oncotarget.2014, 5(17)： 7260-7271.

［9］ Li CW, Xia W, Huo L, et al. Epithelial-mesenchymal transition induced by TNF-α requires NF-κB-mediated transcriptional upregulation of Twist1［J］. Cancer Res.2012, 72(5)： 1290-1300.

［10］ Su YW, Xie TX, Sano D, et al. IL-6 stabilizes Twist and enhances tumor cell motility in head and neck cancer cells through activation of casein kinase 2［J］. PLoS One.2011, 6(4)： e19412.

［11］ Sun X, Cui M, Zhang A, et al. MiR-548c impairs migration and invasion of endometrial and ovarian cancer cells via downregulation of Twist［J］. J Exp Clin Cancer Res.2016, 35： 10.

［12］ Sakamoto T, Kobayashi S, Yamada D, et al. A Histone Deacetylase Inhibitor Suppresses Epithelial-Mesenchymal Transition and Attenuates Chemoresistance in Biliary Tract Cancer［J］. PLoS One.2016, 11(1)：e0145985.

Effects of Knockdown of TWIST1 Gene on Inhibition of self-renewal and the expression of FoxM1 protein in Human Ovarian Cancer OVCAR3-derived Spheroids by DFOG

Dong Wei-Lei1, Ning Ying-Xia2, Chen A3, Xu Chang3, Cui Ying-Hong3, Li Xiang3
(1. Department of Gynaecology and Obstetrics, University of South China, Hengyang 421001, China; 2. Department of Gynaecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China; 3. Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410006, China)

ObjectiveTo investigate the molecular mechanism underlying the inhibitory effects of 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein (DFOG) on self-renewal capability in OVCAR3 derived spheroids via down-regulating the expression of Twist1/FoxM1.MethodsTWIST1 gene was knockdown using TWIST1 shRNA adenovirus infection of OVCAR3-derived spheroids. The capability of self-renewal was detected using sphere-forming assay. And the protein expressions of Twist1 and FoxM1 were analyzed using western bloting.ResultsCompared with the parental cells, OVCAR3-derived spheroids possessed stronger self-renewal capability and over-expressed Twist1 and FoxM1 protein. TWIST1 shRNA effectively inhibited the capability of sphere forming and the expression of Twsit1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids. Twist1 shRNA and DFOG (5 μM) could cooperatively suppress the capability of sphere forming and the expression of Twist1 and FoxM1 in OVCAR3-derived spheroids.ConclusionThe inhibitory effects of DFOG on the capability of self renewal may be associated with regulation of Twist1.

ovariancancer; ovarian cancer stem cell; 7-difluoromethoxyl-5, 4’-di-n-octyl genistein; Twist1; FoxM1

R737. 31

A

1673-016X（2017）05-0004-04

2017-04-15

国家自然青年基金 （No.81301894）; 广东省科技计划项目（No.2014A020211028）; 广州市教育系统科研项目（No.1201410508）

宁映霞, E-mail: nyingxia@163. com