大气CO2不同浓度对灰飞虱获毒与传毒的影响研究

2017-11-07封亚青苏宏华杨益众

环境昆虫学报 2017年5期

封亚青，张燕，苏宏华，杨益众*

(1.扬州大学园艺与植物保护学院，江苏扬州 225009；2.江苏省灌南县农技推广中心，江苏连云港 222500；3.江苏省南通市出入境检验检疫局，江苏南通 226000)

封亚青1，2，张燕1，3，苏宏华1，杨益众1*

本世纪初，由灰飞虱Laodelphaxstriatellus传播的条纹病毒(RSV)引起的条纹叶枯病在长江中下游广大稻区肆虐，给这些地区的水稻生产带来了灾难性影响。本文采用模拟气室法，研究了大气CO23个浓度(370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L)对媒介害虫灰飞虱获毒与传毒的影响。结果表明，灰飞虱获毒个体数与灰飞虱的取食时间成正比，在有毒稻株上取食时间越长，获毒的灰飞虱个体数越多。不同CO2浓度间，取食相同时间后的灰飞虱获毒个体数虽有差异，但没有达到显著水平。鉴于稻株获得RSV与病毒病的症状显现之间存在较长的时间差，本文通过提取水稻植株体内的RNA并借助RT-PCR技术，研究判定被害稻株是否已经获得了RSV，从而间接证明灰飞虱的传毒力。研究结果显示，CO2浓度对灰飞虱的传毒力有影响：470 μL/L CO2浓度条件下灰飞虱的传毒力最强。研究还发现，在处理的3个CO2浓度范围内，灰飞虱只要取食为害稻苗1 h，水稻中就能检测到条纹病毒(RSV)。说明灰飞虱的传毒速率还是较快的。

CO2浓度；灰飞虱；条纹病毒(RSV)；传毒与获毒

当今，以CO2为主的温室气体浓度的上升速度明显加快。据测定，大气CO2的浓度已由19世纪七十年代的280 μL/L上升至现在的406 μL/L，上升了45%。还有研究认为，大气CO2浓度正以每年0.4%左右的速度不断上升，到本世纪末将达到540-970 μL/L(IPCC，2013)。大气CO2浓度升高可影响植物的生长及其一系列的生理特征。研究认为，高CO2浓度可增加光合作用效率、植物的叶面积、地上生物量，进而导致碳水化合物的增加和对水分的利用效率的提高。同时，高CO2浓度可极大降低植物叶片的含氮量，改变植物的化学防御物质等(Lindrothetal.，1993)，从而影响植食性昆虫对植物的取食。一些专家学者对大气CO2浓度升高影响植物的光合呼吸作用与产量构成曾做了大量研究探索(王为民等，2000；赵天宏等，2003；范桂枝等，2008)；也有部分学者研究了棉铃虫HelicoverpaarmigeraHübner、棉蚜AphisgossypiiGlover等害虫对大气CO2浓度升高的响应(陈法军等，2004；吴刚等，2006)。还有一些学者研究阐述了大气CO2浓度与禾谷缢管蚜Rhopalosiphumpadi、西花蓟马Frankliniellaoccidentalis、粘虫Mythimnaseparata等害虫之间的关系(张钧等，2002；刘建业等，2014；陈晓燕等，2017)。

由媒介昆虫灰飞虱Laodelphaxstriatellus(Fallén)传播的条纹病毒(RSV)引起的条纹叶枯病曾是上世纪六十年代长江中下游地区水稻上严重发生的病害，以后就销声匿迹。进入二十一世纪后，条纹叶枯病在长江中下游广大稻区再度大流行，给长江中下游地区的水稻生产带来了灾难性影响，成为这些稻区水稻生产上最重要和最严重的病毒病害(程兆榜等，2007)。本世纪初灰飞虱种群密度的迅速扩大和条纹叶枯病的大面积发生是否与大气CO2浓度的渐渐升高有关，未见前人研究阐述；大气CO2不同浓度对介体灰飞虱的获毒与传毒是否有影响，也未见研究报道。本文采用模拟气室法，研究了大气CO23个浓度(370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L)对媒介害虫灰飞虱获毒与传毒的影响，现将初步研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

试验所用水稻品种为“武运粳7号”。由江苏省武进市农业科学研究所提供。

灰飞虱采自扬州大学实验农牧场小麦田内，带回室内群体饲养在即将分蘖的“武运粳7号”稻苗上。稻苗种植在直径15 cm、高25 cm的大烧杯中，杯口以纱布封住。待灰飞虱交配后，选出雌性成虫放入内有稻苗的试管中进行单管饲养，4 d后逐个测定单管中灰飞虱的带毒率并标记。若成虫带毒，这只试管中的后代基本全带毒；若成虫不带毒，这支试管中的后代基本不带毒。经过几代分离选育和各代虫体获毒率测定，筛选出带毒与不带毒的灰飞虱个体作为试验虫源(张开玉等，2008)。

1.2 试验方法

1.2.1CO2浓度的控制

本试验以普通钢瓶供给气体，以PYX-300Q-B型人工气候箱(中国哈尔滨东联电子公司生产)为空间，形成一个密闭的动态气室，同时以eSENSE-D型CO2浓度控制仪(Sense Air Company, Sweden)和XMT605智能显示仪表(江苏南京法派电器有限公司生产)监控该气室内的CO2浓度(陈法军等，2005)。本试验设定人工气候箱中的温度为25℃，相对湿度60%-80%，光暗比L ∶D=14 ∶10(L=8 ∶00-22 ∶00；D=22 ∶00-8 ∶00)。

设置CO2浓度处理3个：470 μL/L、570 μL/L，另以人工气候箱中的CO2浓度(约370 μL/L)为对照。通过XMT605智能显示仪表全天候监测，结果显示各处理的CO2浓度日波动小于30 μL/L。

1.2.2稻株获取RSV与灰飞虱虫体再获RSV的培养

将种植于烧杯中的苗期水稻分别置于CO2浓度为370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L人工气候箱中，待水稻进入分蘖期，各处理接入带毒率为87%-90%的灰飞虱成虫若干头，分两组处理：一是取食1.0 h、2.0 h、4.0 h、8.0 h后分批剔除取食的虫源，48 h后摘取水稻叶片测定稻株的带毒率；二是继续让带毒飞虱取食至48 h、水稻整体获得条纹病毒(RSV)后剔除带毒虫源(林莉等，1996)作为有毒稻株。

以上述的有毒稻株为试验材料，继续放入CO2不同浓度处理的人工气候箱中，接入饥饿处理 4 h、不带毒的灰飞虱成虫若干，于取食1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、32 h后回收虫源，每个处理回收30头，存入-20℃冰箱中，待测虫体获毒率。不同CO2浓度处理试验均重复3次。

1.2.3虫体获毒率与稻株带毒率检测

1.2.3.1 虫体获毒率测定

斑点免疫检测结合DIBA法(周益军等，2004)。试剂盒由江苏省农科院提供。

基本方法与步骤：测试前用纯净水将0.1 M PBST洗涤缓冲液稀释10倍为0.01 M，再用0.01 M PBST洗涤缓冲液稀释脱脂奶粉至1%浓度放于冰箱冷藏室备用。灰飞虱处理：将1头灰飞虱放在0.2 mL离心管中，然后加入100 μL碳酸盐包被缓冲液，用牙签捣碎(每一个处理换一次牙签)，5000 rpm离心3 min，取上清液3 μL点在硝酸纤维素膜正方格中，常温晾干；将晾干的膜浸入1%脱脂奶粉封闭液中，37℃摇床，30 min；取出膜，浸入用封闭液稀释20000-40000倍的单抗中，37℃摇床，1.5 h；取出膜，用0.01 M PBST洗3次，每次洗3 min；将膜浸入用封闭液稀释2500-3000倍的辣根过氧化物酶标记的二抗中，37℃摇床，1.5 h；取出膜再用0.01 M PBST洗3次，每次洗3 min；将膜浸入新配置的底物溶液中，底物溶液为：10 mL 0.02 MPBS底物缓冲液+7 μL 30%双氧水，37℃摇床，30 min；显色后，用自来水冲洗，常温晾干。

1.2.3.2 水稻叶片带毒率检测

采用嵇朝球等(2005)创制的RT-PCR法。其步骤为：

病毒总RNA的提取：Trizol法。选取植株叶片0.07 g在液氮中研磨至细粉，将细粉移入1.5 mL LEP管中，加入已预冷的Trizol提取液1 mL，震荡均匀，放置5 min后加入200 μL氯仿，剧烈摇晃后，静置5 min，在4℃、12000 rpm条件下离心15 min，取上层液体350 μL于干净离心管，加入相同体积的异丙醇混匀，沉淀10 min，然后在4℃、12000 rpm条件下离心5 min，RNA沉淀于管壁和底部，去掉上清液，室温干燥10 min，加入30 μLDEPC水溶解RNA。

PCR引物的设计：由上海生工生物技术工程服务有限公司帮助完成。

一步法RT-PCR方法鉴定RSV：一步法RT-PCR试剂盒(丁新伦等，2008)。以CP为引物对病毒RNA进行RT-PCR扩增，反应体系参照试剂盒说明书。扩增条件是：50℃ RT反应30 min、94℃ Rtase预变性2 min；94℃变性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸1 min，共进行35个循环；最后72℃保温10 min。18℃保存。

水稻条纹病毒CP蛋白基因的检测。取上述扩增的PCR产物6 μL，用1%的琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像系统(SYNGENE公司)观察和分析电泳结果，所有感染病毒的稻叶在990 bp附近有一条清晰条带，而正常稻叶条带不显。

1.3 统计分析

DPS 7.05版本统计软件进行统计分析，并以Office办公软件Excel和Word为辅助工具。不同处理间的差异显著性比较采用Duncan，s新复极差方法检验(李娟等，2008)。

2 结果与分析

研究发现，在370 μL/L(CK)、470 μL/L和570 μL/L 3个CO2浓度条件下，灰飞虱的获毒个体数均与取食时间有关。即在设定的3个CO2浓度范围内，灰飞虱的获毒个体数均随着取食时间的延长而增加，取食32 h时间后的灰飞虱获毒个体数与取食4 h及短于4 h后的获毒个体数之间存在显著差异(ν1=5，ν2=12，F=5.30>F0.05=3.11)，对于470 μL/L浓度处理，取食16 h后的灰飞虱获毒个体数就与取食4 h及短于4 h后的获毒个体数之间存在显著差异(P<0.05)；其他时间处理间灰飞虱获毒个体数尽管有差异，但没有达到显著水平。研究还发现，3个不同CO2浓度处理对灰飞虱的获毒个体数影响不明显。除取食4 h的处理外，相同取食时间、不同CO2浓度处理之间灰飞虱的获毒个体数虽有差异但都没有达到显著水平(ν1=2，ν2=6，F=0.60

2.2 大气CO2不同浓度对灰飞虱传毒的影响

图1 相同时间不同CO2浓度条件下的灰飞虱获毒个体数Fig.1 The number of Laodelphax striatellus (Fallén) acquired viruses in different carbon dioxide concentrations at the ame time

图2 相同CO2浓度不同处理时间条件下的灰飞虱获毒个体数Fig.2 The number of Laodelphax striatellus (Fallén) acquired viruses in the same carbon dioxide concentration and different treatment time

研究指出，不同的CO2浓度条件对灰飞虱的传毒力有影响。在所设定的3个CO2浓度中，470 μL/L传毒能力最强。无论是带毒灰飞虱在无毒水稻上取食2.0 h、4.0 h还是8.0 h，稻苗的获毒比例均是470 μL/L处理表达量最大，且与对照(370 μL/L)和570 μL/L之间均存在显著差异，而对照(370 μL/L)与570 μL/L处理之间没有显著差异。研究结果还显示，在设定的3个CO2浓度下，带毒灰飞虱只要取食无毒稻株1.0 h，水稻中就能检测到条纹病毒，说明灰飞虱的传毒速度是相当快的。当然，稻苗获毒的比例与灰飞虱在稻株上的取食为害时间有关：如CO2570 μL/L的浓度处理，灰飞虱为害8.0 h后稻株体内的获毒量是取食为害1.0 h的20倍(图3)。

水稻条纹病毒CP蛋白基因检测的结果还显示，本研究除个别稻株内没有检测到病毒存在(图4(3)的A2处理)，绝大多数处理的稻叶中都检测到病毒。说明本试验采用的检测方法既灵敏、也能作为检测灰飞虱传毒速率的重要手段。

图3 不同CO2浓度对灰飞虱取食水稻1 h、2 h、4 h、8 h后稻株内RSV相对actin表达量的影响Fig.3 The quantity of rice carried RSV relative to actin after fed by Laodelphax striatellus for 1 h, 2 h, 4 h, 8 h

(1)370 μL/L(CK)处理(CK treatment)

(2)470 μL/L处理(470 μL/L treatment)

(3)570 μL/L处理(570 μL/L treatment)

注：每个处理重复3次，如A1、A2、A3。Note:Each treatment with three replicates, such as A1, A2 and A3.

3 结论与讨论

Awmack等(1996)在研究CO2浓度升高对取食韧皮部害虫的影响时指出，处理较短时间，害虫的历期不会发生变化；而处理多个世代后，其生长发育受到极大影响，发育速率明显加快。朱橙(2009)的研究也发现，CO2浓度增加对灰飞虱的存活没有明显的影响，但是到第3代时存活率明显提高。由此可见，大气CO2浓度升高对昆虫的作用表现出一个长期的影响、多代的效应。本研究结果显示，不同CO2浓度处理对当代灰飞虱获毒的影响很小。至于灰飞虱在不同浓度的CO2条件下连续饲养几代后的获毒率是否发生变化值得进一步研究。

不同大气CO2浓度对灰飞虱获毒力的影响前人没有相关研究报道。本研究表明，3个不同的CO2浓度对灰飞虱的获毒影响小。如果设置更高的CO2浓度，对灰飞虱的获毒是否有影响还需要做进一步探讨；同时本研究用的是分蘖期的水稻，灰飞虱在水稻不同生育期取食对获毒率有没有影响也需要作深入分析。

营养补偿假说(Nutrient Complementation Hypothesis)指出，高CO2浓度能导致植物营养成分的改变，即植株含氮量降低和C:N比值增加(Bernd and Martine，1999)；林舜华等(1997)对辽东栎的研究表明，高CO2浓度下暗呼吸略微下降但不明显。郭建平等(2002)研究结果表明：高温、高浓度CO2会加快植物的生长进程，促进植物生长速度。本研究结果显示：在570 μL/L CO2浓度条件下，稻株的获毒比例小，而370 μL/L(CK)、470 μL/L CO2浓度条件下稻株的获毒比例高。推测原因可能有二：一是高浓度的CO2条件抑制了灰飞虱的取食；二是高浓度的CO2条件干扰了寄主植物(水稻)的新陈代谢，进而影响稻株体内条纹病毒的表达，具体原因还有待于深入研究。

2）反思日志：反思日志是最常用的方法，对日常教学进行有规律的记录。日志内容可包括对教学内容、过程、方法以及效果的思考与反思，记录典型教学案例并进行反思，在反思的同时会提出相应的解决方案。反思日志是日后教师进行反思的基础，。

据观察，长江中下游稻区近几年发生的水稻条纹叶枯病主要是由携毒的迁出代灰飞虱成虫传播的，而从携毒灰飞虱为害稻株到植株显示病害症状最快需要12 d，最慢需要38 d(孙祥良等，2008)。芮明方等(2007)研究也指出，水稻条纹病毒在稻株体内的潜伏期较长。所以如何快速、准确地对稻苗、越冬寄主植物和灰飞虱是否带毒进行检测意义重大：第一，如果掌握了灰飞虱和越冬寄主植物的带毒情况，就可以进一步预测迁入秧苗田的灰飞虱的带毒情况；第二，如果掌握了水稻秧苗是否带毒，就能主动出击，采取及时、有效的措施控制病害发生。因此，有必要对灰飞虱、主要越冬寄主植物及稻苗带毒情况进行检测。本研究采用提取水稻RNA的方法进行测定，在灰飞虱为害1 h后就能检测到稻株体内是否获毒，而且精度比较高，让快速、准确掌握水稻或越冬寄主植物体内带毒情况成为可能，更为精准测报稻田内条纹叶枯病的发生提供了预警与防范。

References)

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TheimpactofdifferentCO2concentrationsontheacquisitionandtransmissionofvirusesinLaodelphaxstriatellus(Fallén)

FENG Ya-Qing1,2, ZHANG Yan1,3, SU Hong-Hua1, YANG Yi-Zhong1*

(1. School of Horticulture and Plant Protection, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu Province, China; 2. GuanNan Agricultural Technology Extension and Service Center, Lianyungang 222500, Jiangsu Province, China; 3. Nantong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, NanTong 226000, Jiangsu Province, China)

In this early century, stripe virus disease which was caused by rice stripe virus (RSV) transmitted by the small brown planthopperLaodelphaxstriatellus(Fallén), had brought great damages to rice production in Yangtze River region. Effects of CO2concentration in the atmosphere (370 μL/L (the current concentration), 470 μL/L and 570 μL/L) on the acquisition and transmission of viruses inL.striatelluswere studied using a simulation chamber method. The results showed that the number ofL.striatellusthat acquired viruses was proportional to their feeding time, that is, the longer they fed on infected rice plants, the moreL.striatellusacquired viruses. Although there was a difference in the number of infectedL.striatellusafter identical feeding times under different CO2concentrations, this difference was not statistically significant. Due to a long lag between RSV acquisition of rice and symptom occurrence, the RNA of rice plants was extracted to analyze the transmission of viruses inL.striatellususing RT-PCR technique. The results showed that CO2concentration had some influence on the transmissibility of viruses inL.striatellusand that the transmissibility of viruses inL.striatelluswas highest under 470 μL/L CO2. Furthermore, as long asL.striatellusfed on the rice plants for 1 h, RSV could be detected in the plants under the three concentrations of CO2, which indicates that the transmission of viruses byL.striatellusis very rapid.

CO2concentration;Laodelphaxstriatellus(Fallén); rice stripe virus (RSV); virus acquisition and transmission

封亚青，张燕，苏宏华，等.大气CO2不同浓度对灰飞虱获毒与传毒的影响研究[J].环境昆虫学报，2017,39(5):1048-1053.

Q968.1;S433.39

1674-0858(2017)05-1048-06

国家自然科学基金项目(30771416)；江苏省农业三新工程(SXGC[2016]246)

封亚青，女，1983年生，江苏灌南人，硕士研究生，研究方向为昆虫生态学，E-mail：260459269@qq.com

*通讯作者Author for correspondence, E-mail: yzyang@yzu.edu.cn

Received: 2016-05-13; 接受日期Accepted: 2017-06-12