神经干细胞治疗脊髓损伤的研究近况

陈晓丽，李少川，陈久智，石达友



神经干细胞治疗脊髓损伤的研究近况

陈晓丽，李少川，陈久智，石达友

510642 广州，华南农业大学兽医学院/华南农业大学国际中兽医研究所

脊髓损伤具有较高的发病率，除了造成机体四肢瘫痪和半身瘫痪外，还可能产生其他继发性疾病，严重影响患者生活的质量。目前在脊髓损伤的临床治疗中尚未找到确实有效的方法，主要是采用手术减压、冲击疗法、离子通道阻滞剂等治疗措施来控制早期原发性脊髓损伤进一步发展成继发性脊髓损伤，配合日常的康复训练和有效的护理恢复脊髓损伤造成的功能障碍[1]。但是，这些方法在脊髓损伤的临床治疗中，仍未取得实质性进展。

随着人们对干细胞不断地研究探索，干细胞在修复脊髓损伤临床研究中取得了一些新的成果。从 2001 年初，解放军第四六三医院神经外科就开始对干细胞治疗脊髓损伤的治疗基础进行研究，在 2003 年把干细胞治疗应用于临床，到 2008 年已通过干细胞治疗脊髓损伤 400 余例[2]。干细胞在许多神经系统疾病（包括帕金森病、脑卒中、阿尔茨海默病、癫痫和脱髓鞘病变等）治疗中应用，已引起广泛关注。李慧等[3]将 21 日龄 SD 大鼠用戊四氮建立慢性癫痫点燃模型，取新生 24 h SD 大鼠海马，提取、培养及纯化神经干细胞（neural stem cell，NSC）后进行免疫荧光染色标记，在大鼠癫痫发作后的第 7 天，将标记的 NSCs 移植入大鼠侧脑室。结果发现，NSCs 移植入癫痫大鼠海马后能够存活，并且可以降低海马 CA3 区和齿状回 MFS 程度，有效抑制癫痫发作。Ferguson 和Son[4]将 NSCs 通过静脉注射途径移植到局灶性脑缺血模型的大鼠脑内，4 周后观察到移植细胞分化为神经元和胶质细胞，大鼠受损的神经功能有一定程度的恢复。吕颖等[5]为了检测 NSCs 移植后大鼠脑内细胞因子的变化，用 SPF 级的 SD 大鼠制作成帕金森模型后，用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测各纹状体的 TNF-α、IL-1β、IFN-γ 和 IL-4 的含量。结果表明，NSCs 移植后会使宿主微环境内的部分促炎因子（TNF-α、IL-1β）下降，抗炎因子（IL-4）升高，同时伴随具有神经再生和保护作用的促炎因子（IFN-γ）的升高。本文将近年来所研究的神经干细胞的来源、治疗特点、移植途径及作用机制与脊髓损伤治疗相结合作一综述，为应用干细胞治疗脊髓损伤提供理论和实验依据。

1 神经干细胞的来源

神经干细胞的来源广泛，有来源于机体的神经组织，也有来源于机体的其他组织。成年机体组织神经干细胞来源广，但是可提取的数量极少，获取工作程序较为复杂，在获取神经干细胞的同时，有使成体神经功能受到损害的危险性，因此在成年机体组织中提取神经干细胞在临床实际应用中较为罕见。在临床上实际运用比较多的是成年机体非神经组织来源的神经干细胞，特别是血液系统中骨髓来源的成体神经干细胞。曹志勇等[6]应用自体骨髓间充质源神经干细胞通过腰椎穿刺术经蛛网膜下腔鞘内注射移植，治疗 7 例中枢神经系统疾病患者，移植后无不良反应，6 个月后 7 例患者神经功能缺损症状较移植前均有一定程度的改善。说明骨髓来源的成体神经干细胞在移植治疗中枢神经系统疾病中安全、有效（表 1）[7]。

2 神经干细胞的特点

目前神经干细胞还未见有准确定义，一般认为神经干细胞存在于神经系统中，具有多项潜能，有自我更新、多潜能分化、高度增殖和迁移等特性，在含有血清的培养基中，先球形悬浮生长后贴壁生长，并向四周伸展，形成轴突或树突样结构，可分化为成熟的神经元和神经胶质细胞[8]。CD133+/CD34-/CD45-被认为是神经干细胞的表达特征[9]，应用最广的表达特异性分子是神经元中间丝蛋白-神经巢蛋白（nestin），nestin 的表达是暂时的，一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元或胶质细胞，nestin 则被其他中间纤维蛋白所取代[10]。神经干细胞还具有低免疫原性，由于神经干细胞仍是原始细胞处于未分化的阶段[11]，因此它在体内不表达细胞抗原，将神经干细胞移植入机体后降低了机体免疫排斥的可能，从而减少发生免疫排斥的风险。尽管神经干细胞具有低免疫原性，但也不可排除一定不会发生免疫排斥，黄喜军等[12]采用去细胞异种神经复合同种异体脂肪干细胞修复猕猴周围神经缺损，结果表明未产生全身及局部免疫排斥反应，复合同种异体脂肪干细胞移植后也未发现免疫排斥反应。说明神经干细胞移植对机体的免疫排斥反应已经可以通过人工技术进行避免，在临床医学上常见在细胞移植前期先给患者打免疫抑制剂，再进行细胞移植。

神经干细胞具有的多能性，与其特有的分化方式有关。如图 1 所示，神经干细胞分化的子细胞能根据机体需要，分化产生神经系统的各类细胞，有对称分裂及不对称分裂两种分裂方式。其中神经细胞的不对称分裂是起治疗作用的主导因素，通过不对称分裂产生一个祖细胞和另一个干细胞，祖细胞能自发分化生成神经元细胞、成胶质细胞、神经细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞等，另一个干细胞又可以循环这一系列分化，继续分化子代细胞，使机体干细胞库保持基本稳定[13]。

表 1 神经干细胞来源、获取途径和优缺点分析

图 1 神经干细胞分裂示意图（在神经干细胞分化的前体细胞中可以检测到特异性分子nestin 的表达，一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元、胶质细胞、神经细胞等，nestin 则被其他中间纤维蛋白所取代）

3 神经干细胞在脊髓损伤中的移植途径

随着神经干细胞在脊髓损伤临床治疗中的不断研究探索，确保移植细胞能有效抵达脊髓损伤处并发挥其修复的功能是医治脊髓损伤的关键所在。在脊髓损伤后的 7 d 内，机体会产生一系列炎症反应，损伤的微环境不利于干细胞生存，因此在第 7 ~ 15 天这段时间是移植神经干细胞的最佳时机。神经干细胞的移植途径主要有局部注射移植、经脑脊液注射移植、经血液循环注射移植等途径（表2）[14]。

许祖远等[15]制作成年大鼠脊髓全切模型，用 Brdu 标记神经干细胞后经尾静脉注射至大鼠体内，观察神经干细胞静脉移植对脊髓损伤的治疗作用，结果表明：通过静脉移植的神经干细胞能迁移到脊髓损伤处代替受损的神经细胞，重建神经回路。干细胞在动脉血中与在静脉血中相比能在更短的时间内到达作用部位发挥作用，确保干细胞到损伤处的治疗量，提高干细胞的利用率。Lundberg 等[16]将经静脉移植干细胞和经动脉移植干细胞这两种方法作对比，在大鼠的损伤模型中对治疗效果进行比较，在综合比较中发现经动脉移植的神经干细胞的治疗效果比经静脉移植的神经干细胞治疗效果更佳。

4 神经干细胞在治疗脊髓损伤中的作用机制

将神经干细胞运用于脊髓损伤治疗中发现，神经干细胞移植到患者机体后，可在损伤处定向分化成为功能细胞，替代和补充坏死或凋亡的细胞，分泌神经营养因子，对损伤处进行有效的修复，在修复受损的脊髓神经组织中发挥重要的作用。赵锡武等[17]将神经干细胞和骨髓间充质干细胞作为对比，通过静脉注射移植到脊髓半横切模型的大鼠中治疗，结果表明神经干细胞移植的治疗效果更为明显。目前 NSCs 移植治疗脊髓损伤的研究仍处于临床前期研究阶段，但从许多动物实验及少量的临床研究已经取得的成果可以证实，NSCs 移植可以促使脊髓损伤的神经功能恢复。其可能的作用机制有：

表 2 神经干细胞在脊髓损伤中的移植途径和优缺点分析

4.1 替代作用

通过将神经干细胞直接移植到脊髓损伤处或间接激活体内的神经干细胞的方法，使移植到体内的神经干细胞根据机体损伤需求进行分化，可定向分化为神经元和胶质细胞等功能细胞。胶质细胞具有分泌营养因子的功能，能修复受损的轴突促进其再生，同时胶质细胞也可以产生多种细胞外基质，对脊髓空腔进行填充并与机体体内已有的神经细胞结构有效结合，而达到部分修复脊髓损伤的目的。徐委和程黎明[18]通过对神经营养因子修复脊髓损伤的研究，发现神经营养因子可以有效抑制脊髓损伤后神经元凋亡，促进神经再生及分化，联合应用神经营养因子修复脊髓损伤具有协同作用，如基因转染技术、生物工程技术等。Lepore 等[19]将从大鼠脊髓组织分离的脊髓神经干细胞，移植到脊髓损伤的大鼠模型中，用双重免疫染色法进行检测，结果证实移植的神经干细胞可以向神经元分化，可以通过电镜观察到新生的神经元。Lee 等[20]研究发现移植入人神经干细胞能够促进脊髓半切犬的神经功能恢复，被植入犬体内的神经干细胞可进一步分化为成熟神经元和少突神经胶质细胞。说明了直接移植神经干细胞到机体内，神经干细胞的替代疗法能对脊髓损伤处起到有效的修复作用。

4.2 基因治疗

基因治疗指利用基因手段将外源目的基因导入神经干细胞内，增殖培养后导入机体脊髓损伤处发挥效应，在机体内可长期和安全地产生神经营养因子和促生长因子的一种用以修复脊髓损伤的治疗方法[21]。将携带治疗作用的目的基因移植到将注入机体的神经干细胞中，使携带目的基因的神经干细胞在损伤处达到细胞替代和基因治疗的双重作用。邓兴力[22]构建神经营养因子 3 基因直接表达载体后，应用核转染技术将神经营养因子 3 基因转入神经干细胞中，对神经营养因子 3 修饰的神经干细胞在大鼠脊髓损伤的治疗效果进行综合性检测，结果显示神经营养因子 3 修饰的神经干细胞移植更能改善脊髓损伤大鼠的脊髓功能，不仅能使更多的移植细胞存活，还能促使被移植的神经干细胞进一步分化成少突胶质细胞。与未经修饰的神经干细胞的治疗效果进行研究比较得出，携带有神经营养因子 3 的神经干细胞在大鼠脊髓损伤中的治疗效果更佳。

4.3 诱导疗法

选择合适的诱导因子是神经干细胞在脊髓损伤治疗中的推进剂，不仅可以诱导机体内自身的神经干细胞进行分化，也可以增加异体注射的神经干细胞疗效。曲扬[23]将姜黄素与神经干细胞联合在一起治疗脊髓损伤，姜黄素有抗炎抗氧化作用，可为 NSCs 移植提供良好微环境，还可促进神经系统 BDNF 表达，并促进 NSCs 分化迁徙，两者联合能够显著地提高神经干细胞分化为神经元的比例，并减少神经元的凋亡。张坤[24]利用骨髓来源的 M1/M2 型极化巨噬细胞条件性培养基，体外培养小鼠胚胎脊髓来源的神经干/前体细胞（NS/PCs），将 NS/PCs 分别与 M1 或 M2 巨噬细胞联合移植入正常和损伤的小鼠脊髓后，移植的 M1 型巨噬细胞可促进 NS/PCs 向星形胶质细胞方向分化；而M2 型巨噬细胞却可以使 NS/PCs 更多地分化为神经元及少突胶质细胞，分化的神经元可以与宿主神经元细胞发生整合，促进脊髓损伤后运动功能的恢复。选择合适的诱导干细胞因子，可以使其与神经干细胞互补治疗，诱导神经干细胞进行分化，互相发挥最大的疗效，促进损伤处的恢复。但如何选择最佳的诱导因子与神经干细胞作为最佳组合，仍需进一步研究。

5 小结

NSCs 的发现不仅给称为“不治之病”的脊髓损伤患者带来希望，也给其他神经系统常见疾病带来光明，近年来很多学者着手干细胞治疗神经系统疾病的临床应用研究工作。但是，由于目前仍对 NSCs 的认识与了解有限，NSCs 在治疗脊髓损伤中仍存在一些迫切需要解决的问题。例如，神经干细胞虽具有低免疫原性，但在异体移植的治疗中仍存在免疫排斥风险，神经干细胞在生物体内的成活率及增殖分化能力是否会受其他因素的影响而致瘤或消耗等问题，如何有效地解决以上问题将是推动神经干细胞安全有效应用的关键一步。研究结果表明，随着神经组织工程技术的逐渐成熟，利用神经干细胞所具备的功能特性，将神经干细胞移植到脊髓损伤处，能有效地促进受损神经组织的修复，提高神经干细胞治疗脊髓损伤的临床疗效。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.008

国家十三五重点研发计划项目（2016YFD0501010）

石达友，Email：shidayou@scau.edu.cn

2017-07-22