HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量

刘玉斌，于爱平，刘农乐，吴祖泽，靳继德



HPLC法定量测定酵母发酵上清液中重组新蛭素的含量

刘玉斌，于爱平，刘农乐，吴祖泽，靳继德

100022 北京工业大学生命科学与生物工程学院（刘玉斌）；100850 北京，军事医学科学院放射与辐射医学研究所（刘玉斌、于爱平、刘农乐、吴祖泽、靳继德）

建立 HPLC 技术定量测定发酵上清液中重组新蛭素（EH）含量的方法，用于监测发酵过程中EH 的表达量变化与诱导时间的关系，使 EH 产量最大化。利用 HPLC 技术建立 EH 的检测方法，通过对该方法的灵敏度、精密度和加标回收率实验的考察，确立该方法的可行性；利用该方法对 EH 样品进行稳定性考察，并对酵母发酵上清液进行跟踪检测。实现了对发酵过程中发酵上清液中 EH 的实时监测。EH 在 214 nm 处有较强的特异性吸收峰，其吸收峰面积与含量存在很好的线性关系，2= 0.9995，EH 线性浓度范围在 0.012 ~ 4.8 mg/ml。该测定方法具有很好的精密度，样品多次重复测定的 RSD 值为 1.4227%；加标回收率在 95% ~ 98%。应用该方法对 EH 样品的稳定性测定结果显示，样品 4 ℃保存稳定性较好，24 h 内样品主峰面积百分比 > 95%，在 20 ℃条件下，8 h 内样品稳定性良好，主峰面积百分比 > 95%。该方法准确度高、重复性好，进行测定时，可根据 EH 的特异吸收峰，对发酵过程中发酵上清液中 EH 含量进行实时定量测定。测定结果显示，在一定时间范围内，EH 的表达量与诱导时间成正相关。本研究建立了 HPLC 技术检测 EH 含量的方法，该方法可用于发酵过程中 EH 的实时定量监测，使 EH 的产量达到最大值，为 EH 的临床样品制备提供有力支持。

酵母表达系统； 重组新蛭素； 高效液相色谱； 实时监测

血栓性疾病发病率逐年增高，严重威胁着人类的健康和生命。抗凝类药物是预防和治疗血栓性疾病的重要手段，但抗凝药普遍存在的出血副作用给临床用药造成极大的不便。重组新蛭素（EH）是运用生物工程技术在水蛭素的氨基末端连接可被凝血因子Xa/XIa 识别切割的多肽而成，该多肽封闭了水蛭素的抗凝活性，但经过凝血因子 Xa/XIa 酶解后，EH 可产生抗血栓的作用。EH 这种结构特点和作用机制减少了系统出血的风险，提高了抗栓的特异性和作用效率[1-2]。作为一种新型抗凝药物，新蛭素的研发将对血栓性疾病的预防和治疗起到重要作用。EH 采用毕赤酵母表达系统进行生产[3]。在发酵生产过程中，为了监测目的蛋白表达与甲醇诱导之间的关系，需要经常对目的蛋白的表达量进行检测，以选择最佳诱导条件。SDS-PAGE 电泳、毛细管电泳[4-5]是进行目的蛋白分析的常规方法，然而它们不但定量不精确，而且耗时较久。特别是 EH 蛋白在发酵过程中稳定性较差，容易发生降解。在发酵后期，EH 蛋白可在 4 ~ 8 h 内迅速降解，用常规的检测方法不能及时有效地反馈发酵液中 EH 蛋白含量的变化。如何用一个新方法既精确又快速地检测发酵过程中 EH 的表达情况是本研究的重点。反相高效液相色谱在生物技术分离纯化分析中具有重要作用，广泛用于多肽、蛋白质分离纯化工艺中，具有较高的分辨率[6-7]，可以快速、准确地分析发酵上清中各种蛋白的组成及含量。目前，高效液相色谱分析蛋白在国内外已经进行了一定的研究，贡雯玉等[8]用高效液相色谱法检测出鲫鱼不同组织中的胶原蛋白含量；刘利娟等[9]用反相高效液相色谱法测定鲜牛乳中的乳清蛋白，得到的蛋白浓度与 HPLC 峰面积均有很强的线性关系。本实验室已经建立了反相高效液相色谱技术分析 EH 纯度的方法，在此基础上，本研究拟采用 HPLC 技术建立快速定量检测 EH 含量的方法，以用于发酵过程中目的蛋白的动态监测。

1 材料与方法

1.1 材料

HPLC 系统为美国 Agilent 公司产品，DAD 检测器、色谱柱为 TechMate C18-ST，5 μmol/L，4.6 mm × 250 mm，为北京泰克美高新技术有限公司产品；乙腈（色谱级）购于Fisher Chemical 公司；三氟乙酸（色谱级）购自 Acros Organics 公司；发酵罐购自德国 B.Braun Biotech International 公司；重组新蛭素 EH 原液标准品（批号：20161109）为本实验室制备，纯度 > 97%。

1.2 方法

1.2.1 HPLC 检测方法 流动相 A 为含 0.1% 三氟乙酸的水溶液，流动相 B 为含 0.1% 三氟乙酸的乙腈溶液，60 min 内 5% ~ 100% 流动相B 进行梯度洗脱，60 ~ 65 min 内 100% ~ 5% 流动相B 梯度洗脱，65 ~ 80 min5% 流动相B 进行平衡，流速 1.0 ml/min，检测波长 214 nm，柱温 30 ℃。

1.2.2 线性关系及灵敏度考察 取 EH 原液标准品（24 mg/ml），分别稀释5、10、20、30、50、100、250、500、1000、2000、4000 倍；浓度分别为 4.8、2.4、1.2、0.8、0.48、0.24、0.096、0.048、0.024、0.012、0.006 mg/ml，用反向高效液相色谱仪进行检测，方法同 1.2.1，进样量为 4 μl。

1.2.3 精密度考察 取 EH 原液标准品（24 mg/ml）稀释至 0.24 mg/ml，用反向高效液相色谱仪进行检测，重复进样 8 次，方法同 1.2.1，进样量 4 μl，得 EH 的峰面积，计算其 RSD 值。

1.2.4 加标回收率 在一定量 EH 发酵离心上清（250 μl）中添加等体积的不同浓度（3 组，依次为 0.48、0.24、0.096 mg/ml）的 EH，混匀，用反向高效液相色谱仪进行检测，方法同 1.2.1，进样量为 4 μl，计算 EH 的加标回收率。

加标回收率（%）=（实测值 – 发酵离心上清中 EH 含量）/添加值 × 100%

1.2.5 样品稳定性考察 取同一 EH 样品溶液（2.4 mg/ml）在 4 ℃和 20 ℃分别放置 0、4、8、12、16、20、24 h，用反向高效液相色谱仪进行检测，方法同 1.2.1，进样量 10 μl，测定其峰面积，分析主峰百分比。

1.2.6 发酵上清检测 在重组新蛭素发酵过程中，诱导并开始收集样品，每 4 h取一次样，发酵液经 8000 r/min 离心 5 min 后取上清，上清经 0.22 μm 的滤器过滤后，用反向高效液相色谱仪进行检测，方法同 1.2.1，上样量为 4 μl。

2 结果

2.1 色谱检测波长的选择

取同一样品分别在 214、225、238、280 nm 处检测（图 1），在 214 nm 处的光谱区域蛋白吸收灵敏度高，并且基线平稳，在 280 nm 处吸收值较低，其他吸收波长处基线噪声大，基线波动大，并且发酵液上清中 EH 的含量比较低，故选用214 nm 为检测波长。

A

B

C D

图 1 不同紫外检测波长（A：214 nm；B：225 nm；C：238 nm；D：280 nm）分析 EH 的 HPLC 图谱

Figure 1 HPLC chromatograms of EH at different wavelengths (A: 214 nm; B: 225 nm; C: 238 nm; D: 280 nm)

2.2 线性关系及灵敏度考察

蛋白浓度 2.4 mg/ml，进样量为 4 μl 的HPLC 图谱如图 2。对 12 组峰面积进行积分，以 EH 蛋白浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线，得到回归方程 Y = 5 × 106X + 62767（2= 0.9995），结果 EH 溶液在浓度 0.012 ~4.8 mg/ml 范围内呈现良好的线性关系（图 3），蛋白浓度在0.012 mg/ml 以下和 4.8 mg/ml 以上不在线性范围内；灵敏度考察，本实验中 EH 的最低检测限为 0.012 mg/ml、最高检测限为 4.8 mg/ml。

mAU 时间（min）Time (min)

Figure 2 HPLC chromatogram of EH standard solution at 2.4 mg/ml

2.3 精密度考察

得到 EH 的 8 次重复 HPLC 图谱，依次积分，得到的峰面积值为 1164916、1143475、1131982、1123361、1135024、1115562、1162181、1144081，峰面积平均值为 1140073。其峰面积 RSD = 1.4227%（n = 8），变异系数小于 10%，精密度良好，符合测定要求。

峰面积Peak area25 × 106 20 × 106 15 × 106 10 × 106 5 × 106 0 1 2 3 4 5 浓度（mg/ml）Concentration (mg/ml)

Figure 3 Standard curve of EH by HPLC

2.4 加标回收率

在 EH 发酵离心上清中添加等体积的不同浓度的 EH 的加标回收率试验结果（表 1）显示，测得发酵液上清峰面积为 1274440，对应的蛋白浓度0.2423 mg/ml，加入的三个不同浓度梯度 EH 的样品的实测峰面积分别为 1832514、1243183、902712，其对应的蛋白浓度分别为 0.3540、0.2361、0.1680 mg/ml。根据公式算得回收率分别为 97.02%、95.79%、97.60%，结果表明在该出峰时间没有其他杂蛋白的干扰，因此该方法用于 EH 发酵上清中目的蛋白的跟踪检测可靠性较高。

2.5 样品稳定性考察

HPLC 测定结果显示，在 4 ℃环境下，样品浓度为 2.4 mg/ml 时，24 h 内样品稳定性良好，主峰面积百分比 > 95%（表 2），在 20 ℃环境下，8 h 内样品稳定性良好，主峰面积百分比 > 95%（表 3）。

表 1 加标回收率

表 2 4 ℃稳定性考察

表 3 20 ℃稳定性考察

2.6 发酵上清检测

从甲醇诱导开始，每 4 h 取一个样，进行 HPLC 检测。发酵液上清的 HPLC 图谱（图 4）。以诱导时间为横坐标（X），HPLC 目的蛋白峰面积为纵坐标（Y）绘制工作曲线（图 5）。HPLC 的数据显示，在一定时间范围内，EH 的表达量与诱导时间成正相关，在诱导 100 h 时，目标蛋白峰峰面积达到最大值，EH 最大表达量 0.51 mg/ml，之后 EH 出现降解，108 h 时发生明显降解。

3 讨论

反相液相色谱柱填料主要以硅胶为基质，在其表面键合非极性的十八烷基官能团（ODS）称为 C18 柱，C18 柱稳定性较高，长的烷基链保护了硅胶基质，基团空间体积较大，有效孔径小，C18 色谱柱更适合分离小分子化合物[10-11]。其他常用的反相柱还有 C8、C4、C2 和苯基柱等。C4、C2 常用来分离分子量较大的蛋白，C8 用来分离中等大小的蛋白，EH的分子量约为 7 kD，因此本实验选用 C18 来分析 EH 蛋白。常用的蛋白紫外检测波长有214、225、238、280 nm[12]，因为蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280 nm 处具有最大吸收，并且各种蛋白质的这三种氨基酸的含量差别不大，因此紫外吸收法测定蛋白质含量常选用280 nm 处的吸光度值。但由于蛋白质溶液在 280 nm 处的吸收峰较弱，当蛋白含量很低的时候则不能使用 280 nm 的吸光度测定。蛋白质溶液在 238 nm 处的光吸收值的强弱，与肽键的多少成正比，但多种有机物，如醇、酮、醛、醚、酰胺类和过氧化物等都对测定结果有干扰作用。本研究采用 214 nm 吸光度值进行测定，结果证明，在 214 nm 处的光谱区域EH 蛋白吸收灵敏度高，并且基线平稳，可以很好地反映溶液中的蛋白含量。

与传统的电泳技术检测发酵上清重组新蛭素含量的方法相比，HPLC 技术具有操作简便、分析速度快、准确度和精确度高、重复性好等优点[13]，可以快速准确地分析出发酵过程中 EH 的表达量，具有较强的实用性。该法弥补了目前该类蛋白检测方法的不足，做到发酵过程中 EH 表达量的实时监测，也为其他类似的蛋白含量的测定提供了参考。

mAU 时间（min）Time (min)

Figure 4 HPLC chromatogram of fermentation supernatant

峰面积Peak area30 × 105 25 × 105 20 × 105 15 × 105 10 × 105 5 × 105 0 20 40 60 80 100 120 诱导时间（h）Induction Time (h)

Figure 5 The relationship between peak area of EH in fermentation supernatant and different induction time

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Determination of recombinant neorudin in yeast fermentation supernatant by HPLC

LIU Yu-bin, YU Ai-ping, LIU Nong-le, WU Zu-ze, JIN Ji-de

College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100022, China(LIU Yu-bin); Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China (LIU Yu-bin,YU Ai-ping, LIU Nong-le, WU Zu-ze, JIN Ji-de)

To develop a practical method for the determination of recombinant neorudin (referred to as the EH) in yeast fermentation supernatants by HPLC, in order to monitor of the relationship between the expression of recombinant EH and induction time during the fermentation process to optimize the induction time for maximizing the yield of EH.The relationship between the EH and ultraviolet absorption was detected by HPLC to establish a method to determine the quantity of EH protein. The feasibility of the method was further validated with regard to the sensitivity, precision and recovery rate. The stability of EH and the trace EH in yeast fermentation supernatants were examined using the method.A strong absorption peak at 214 nm was found for EH, having high sensitivity with RSD value of 1.4227%. Good linearity in the EH concentration range of 0.012 - 4.8 mg/ml with2= 0.9995 was observed. Standard addition recovery rate was between 95% and 98%. The result of the EH stability showed that the sample had a good preservation stability, with main peak area percentage being over 95% at 4 ℃ for 24 h or at 20 ℃ for 8 h. The expression of EH in yeast fermentation supernatantswas related to the induction time of methanol.The method for detecting the contents of EH by HPLC is established. Real-time monitoring of EH in yeast fermentation supernatants to get the maximum production of EH will be achieved.

Yeast expression system; Recombinant neorudin; HPLC; Real-time monitoring

JIN Ji-de, Email: jinjide505@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.002

国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09102301-008）

靳继德，Email：jinjide505@163.com

2017-07-21