rhGH联合5-FU治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的作用及机制

胡承浩，罗清钦，吴峰，王丹，朱圣明，陈宇，王科，柴晶晶，段奇文



rhGH联合5-FU治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的作用及机制

胡承浩，罗清钦，吴峰，王丹，朱圣明，陈宇，王科，柴晶晶，段奇文

442000 十堰，湖北省十堰市太和医院肿瘤科

探讨重组人生长激素（rhGH）联合氟尿嘧啶（5-FU）治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用机制。选取成功建模的人胃癌 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠 72 只，采用随机数字表法分为空白组（等量生理盐水处理）、GH 组（rhGH 2 IU/(kg·d)）、5-FU 组（5-FU 25 mg/(kg·d)）、联合组（rhGH 2 IU/(kg·d) + 5-FU25 mg/(kg·d)），每组 18 只，对比各组小鼠的体质量、荷瘤体积、抑瘤率、肿瘤细胞周期占比、肿瘤组织中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白的表达，观察小鼠的血生化指标。5-FU 组、联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量、S 期细胞占比显著的低于空白组和 GH 组（< 0.05），抑瘤率、肿瘤细胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期占比、Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达水平显著的高于空白组和 GH 组（< 0.05）；5-FU 组与联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量及抑瘤率、肿瘤细胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比、Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（> 0.05）；5-FU 组的白蛋白、总蛋白、白细胞、红细胞、血小板水平均低于空白组、GH 组及联合组（< 0.05），谷丙转氨酶水平高于空白组、GH 组及联合组（< 0.05）；联合组白细胞水平较空白组和 GH 组降低（< 0.05）。rhGH 联合 5-FU 治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤不影响 5-FU 的抗癌效果，同时可以改善 5-FU 引起的体质量减低及相关化疗毒副作用。

重组人生长激素； 氟尿嘧啶； 胃癌； 移植瘤

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其发病率较高，在我国所有恶性肿瘤中位居第 2 位，致死率位居第 3 位，严重威胁着人们的生命健康[1-2]。随着医疗水平的不断发展，胃癌的发病率有一定的下降，但仍然是目前威胁人们健康的主要疾病之一，其发病原因有很多，但多数与饮食有关[3-4]。目前临床上一般采用外科手术的方式进行治疗，但多数患者在确诊时已为中晚期，单纯手术并不能切除远处的转移灶，治疗效果不理想，需给予化疗进行辅助治疗[5-6]。人生长激素是一种由垂体分泌的肽类激素，可促进蛋白质合成并减少分解代谢，并能改善氮平衡状态[7]。也有研究表明[8]，人生长激素可能具有促进肿瘤细胞有丝分裂和肿瘤增长的潜在功能，但能否应用于肿瘤的治疗仍不太清楚。为此，本研究选取成功建模的人胃癌 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠，分别给予重组人生长激素（rhGH）、5-FU 以及 rhGH 联合 5-FU 进行干预，探讨分析了 rhGH 联合 5-FU 治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用机制，旨在为临床提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 选取人胃癌 MKN-45 细胞成功建模的 BALB/c-nude 人胃癌裸小鼠皮下移植瘤模型 72只，均为清洁级，体质量 18 ~ 22 g，购自复旦大学动物实验中心，喂养于 23 ~ 25 ℃，相对湿度 45% ~ 60%，光照 12 h 的环境中。

1.1.2 实验仪器与药品 5-FU（0.25 g/10 ml）购自上海旭东海普药业有限公司；重组人生长激素购自瑞士雪兰诺药厂；DMEM 干粉培养基、0.2% 胰酶、PI 及 Annexin V 均购自杭州四季青生物材料有限公司；溴化丙啶购自美国 Sigma 公司；胎牛血清、SP 免疫组化染色试剂盒和 DAB 显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物科技公司；Caspase-8 和 Caspase-9 鼠抗人单克隆抗体均购自晶美生物工程有限公司。

TDL-5 型离心机购自上海安亭仪器公司；LH50A 型显微镜购自日本奥林巴斯公司；EPICS-XL 型流式细胞仪购自美国 Beckman Coulter 公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及干预方法 将 72 只小鼠随机分为空白组、GH 组、5-FU 组和联合组，每组18 只，其中 GH 组小鼠皮下注射 rhGH，剂量为2 IU/(kg·d)，5-FU 组小鼠腹腔注射 5-FU，剂量为 25 mg/(kg·d)，联合组小鼠皮下注射 rhGH2 IU/(kg·d)，腹腔注射 5-FU 25 mg/(kg·d)，空白组每日皮下和腹腔分别注射生理盐水 0.2和 0.5 ml，连续给药 10 d。末次给药 24 h 后处死裸鼠，将肿瘤组织完整剥除，观察瘤体大体形态，一部分以 10% 多聚甲醛进行固定，常规石蜡包埋后作连续切片，厚度约为 5 μm；另一部分保存于–80 ℃超低温冰箱中备用。

1.2.2 免疫组化染色 将肿瘤组织切片脱蜡处理后采用免疫组化染色法（SP）进行染色，一抗为鼠抗人 Caspase-8、Caspase-9，二抗为生物素化标记的 IgG，以 PBS 代替一抗作为阴性对照，DAB 溶液显色后苏木精复染，甘油明胶封片后显微镜下观察结果，具体检测步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.3 瘤体体积测量及肿瘤凋亡率计算 每 2 天采用游标卡尺测量 4 组小鼠荷瘤的长径与横径，计算荷瘤体积 V = 长径× 横径2/2，肿瘤细胞凋亡率=（空白组瘤体质量 – 实验组瘤体质量）/空白组瘤体质量 × 100%。

1.2.4 肿瘤细胞周期分布检测、血生化指标检测方法 将肿瘤组织用眼科剪剪碎，并用眼科镊子轻轻捻搓，以生理盐水不断冲洗，随后将混浊液进行过滤，并以 1000 r/min 离心 10 min。弃掉上清液后将沉淀以 70%乙醇（4 ℃预冷）固定，加入 Rnase 酶进行消化，随后在 4 ℃条件下加入 1 ml 溴化丙啶（PI）避光染色 30 min，过滤制成单细胞悬液，利用流式细胞仪进行检测，同时应用MuticycleAV 分析软件对 DNA 周期进行拟合分析，并计算出细胞周期分布的百分率。

末次给药 24 h 后以摘除眼球法进行取血，检测白蛋白、总蛋白、血常规、谷丙转氨酶等常规生化指标。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠的体质量变化

给药前，各组小鼠体质量差异无统计学意义（> 0.05）；给药后，5-FU 组小鼠体质量较其他组显著降低（< 0.05），GH 组、联合组小鼠的体质量与空白组比较差异不具有统计学意义（> 0.05）（表 1）。

表 1 各组小鼠的体质量变化（，g）

注：*与空白组和 GH 组比较，< 0.05。

Note:*Compared with blank group,< 0.05.

2.2 各组小鼠的荷瘤体积、荷瘤质量、抑瘤率比较

5-FU 组、联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量显著的低于空白组和 GH 组（< 0.05），抑瘤率显著的高于空白组和 GH 组（< 0.05）；5-FU 组与联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量及抑瘤率比较，差异无统计学意义（0.05）（表 2）。

2.3 各组小鼠的肿瘤组织中细胞周期占比比较

5-FU 组、联合组小鼠肿瘤细胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期占比高于空白组和 GH 组（< 0.05），S 期细胞占比显著低于空白组和 GH 组（< 0.05）；5-FU 组与联合组小鼠肿瘤细胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比比较，差异无统计学意义（> 0.05）（表 3）。

2.4 各组小鼠的肿瘤组织中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达

5-FU 组、联合组小鼠肿瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达水平高于空白组和 GH 组（< 0.05）；5-FU 组与联合组小鼠肿瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（> 0.05）（表 4）。

表 2 各组小鼠的荷瘤体积、荷瘤质量、抑瘤率比较（）

注：*与空白组比较< 0.05，#与 GH 组比较，< 0.05。

Note:*Compared with blank group,< 0.05,#Compared with the GH group,< 0.05.

表 3 各组小鼠的肿瘤组织中细胞周期占比比较（）

注：*与空白组和 GH 组比较，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05.

表 4 各组小鼠的肿瘤组织中 Caspase-8、Caspase-9蛋白比较（，OD值）

注：*与空白组和 GH 组比较，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05.

2.5 各组小鼠的血生化指标比较

5-FU 组的白蛋白、总蛋白、白细胞、红细胞、血小板水平均低于空白组、GH 组及联合组（< 0.05），谷丙转氨酶水平高于空白组、GH 组及联合组（< 0.05）；联合组白细胞水平较空白组和 GH 组降低（< 0.05）（表 5）。

3 讨论

胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，具有发病率高、死亡率高等特点，也是目前国际间最为重要的健康危机之一[9-10]。胃癌的发病与多种因素有关，如社会经济状况、饮食因素、环境因素等，而胃幽门螺杆菌感染、亚硝胺等化学致癌物质以及遗传因素、霉菌感染及某些微量元素缺乏等因素都与其发生和发展有着密切的关系[11]。目前临床上治疗的方式主要是外科手术和放疗、化疗等，虽然能取得一定的效果，但多数患者就诊时已属晚期，手术效果较差，患者的生存率较低[12]。化疗是治疗中晚期胃癌患者的重要手段，其主要是利用化学药物抑制肿瘤细胞的生长繁殖，或是大面积杀死肿瘤细胞和促进肿瘤细胞的分化，对肿瘤的原发灶、转移灶和亚临床转移灶均有一定的治疗作用，但长期治疗会导致患者出现身体衰弱、精神萎靡不振、白细胞和血小板下降等严重的毒副作用，不利于患者的预后效果[13]。因此，如何寻找新型有效且副作用少的化疗药物来提高患者的预后也是目前广大医师关注的重点和难点。重组人生长激素具有纠正负氮平衡、促进伤口愈合及提高手术耐受性等作用，在临床上得到了广泛的应用，但其能否应用于肿瘤的治疗仍未可知。但也有研究表明[14]，重组人生长激素与化疗药物可能有一定的协同作用，可提供化疗药物的疗效，但其具体机制仍不太清楚。为了进一步探讨rhGH 联合 5-FU 治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤的效果及作用机制，本研究对 MKN-45 裸鼠皮下移植瘤模型小鼠分别给予 rhGH、5-FU 以及 rhGH 联合 5-FU 进行干预，检测分析了各组小鼠的体质量、荷瘤体积、抑瘤率、肿瘤细胞周期占比、肿瘤组织中 Caspase-8、Caspase-9 蛋白的表达以及血生化指标。

表 5 各组小鼠的血生化指标比较（）

注：*与空白组和 GH 组比较，< 0.05，#与联合组比较，< 0.05。

Note:*Compared with blank group and GH group,< 0.05,#Compared with the combination group,< 0.05.

3.1 rhGH 联合5-FU 对小鼠体质量变化的影响分析

研究表明，晚期肿瘤患者多伴有严重的代谢异常，机体营养不良的发生率很高，甚至会诱发恶病质的发生，严重影响肿瘤病人的生存期。营养不良或恶病质还会导致患者对化疗的耐受性明显降低，进而影响抗肿瘤的疗效；而化疗药物的使用还可能会引起患者食欲不振等的发生，进一步加重营养不良。本研究发现，给药后 5-FU 组小鼠体质量较其他组显著降低，而 GH 组、联合组小鼠的体质量与空白组比较差异不具有统计学意义，提示重组生长激素可明显改善 5-FU 引起的体质量减低状况，其原因可能是生长激素具有代谢调理作用，不但能促进蛋白质合成和维持氮平衡，还能增加脂肪氧化分解和糖异生，进而改善机体的营养状态。

3.2 rhGH 联合 5-FU 抗癌效果分析

Caspase-8 和Caspase-9 蛋白作为细胞凋亡的关键蛋白酶，其诱导表达与肿瘤细胞的凋亡发生和发展有着密切的联系。本研究发现，5-FU 组、联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量显著低于空白组和 GH 组，抑瘤率显著高于空白组和 GH 组，但 5-FU 组与联合组小鼠荷瘤体积、荷瘤质量及抑瘤率比较并无明显差异。同时发现，5-FU 组与联合组小鼠肿瘤细胞 G0 期/G1 期、G2 期/M 期、S 期占比比较差异也无统计学意义；5-FU 组与联合组小鼠肿瘤 Caspase-8、Caspase-9 蛋白表达水平比较也无明显差异，提示 rhGH 联合 5-FU 并不会改变 5-FU 的抗肿瘤效果，具有一定的应用价值。也有研究表明，rhGH 联合化疗治疗肿瘤可能会增加化疗敏感性，进而提高疗效，但具体机制仍需作进一步的研究[15]。

3.3 rhGH 联合5-FU 减毒效果分析

5-FU 是目前较为常用的抗癌药物之一，其对多种肿瘤如消化道肿瘤、乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、子宫颈癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌（局部涂抹）、外阴白斑（局部涂抹）等均有一定疗效，但 5-FU 也具有非常明显的毒副作用，主要表现为骨髓抑制、胃肠道反应、脱发等。本研究发现，5-FU 组的白蛋白、总蛋白、白细胞、红细胞、血小板水平均低于空白组、GH 组及联合组，而谷丙转氨酶水平高于空白组、GH 组及联合组；联合组白细胞水平较空白组和 GH 组降低，提示rhGH 联合 5-FU 可明显减轻 5-FU 的毒副作用，其机制可能是 rhGH 在改善机体营养不良和恶病质状态的同时还能提高机体对化疗的耐受性，进而减少并发症的发生；rhGH 还具有增加机体免疫功能和细胞的活性的作用，可进一步降低化疗药物的毒副作用。但本研究限于研究样本的不足，对于 rhGH 联合 5-FU 治疗胃癌的具体临床应用价值仍需作进一步的深入研究。

综上所述，hGH 联合 5-FU 治疗人胃癌裸小鼠皮下移植瘤不影响 5-FU 的抗癌效果，同时可以改善 5-FU 引起的体质量减低及相关化疗毒副作用。

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Inhibitory effect of rhGH combined with 5-FU on human gastric cancer transplanted in nude mice

HU Cheng-hao, LUO Qing-qin, WU Feng, WANG Dan, ZHU Sheng-ming, CHEN Yu, WANG Ke, CHAI Jing-jing, DUAN Qi-wen

Oncology Department, Taihe Hospital, Shiyan 442000, China

To investigate the effect of recombinant human growth hormone (rhGH) in combination with fluorouracil (5-FU) on human gastric cancer subcutaneously transplanted in nude mice and its mechanism.72 MKN-45 tumor model nude mice were randomly divided into blank group (equal volume saline), GH group [rhGH2 IU/(kg·d)], 5-FU group [5-FU 25 mg/(kg·d)], and combination group [rhGH 2 IU/(kg·d) + 5-FU 25 mg/(kg·d)], The expression of Caspase-8 and Caspase-9 in tumor tissues were observed, and the blood biochemical indexes of the mice were measured.Tumor volume and mass, as well as S phase cell proportion in the 5-FU group was significantly lower than that in the control group and GH group (< 0.05), while the inhibition rate of tumor cells, and Caspase-8 and Caspase-9 expression levels were higher in the 5-FU group than that in the control group and GH group (< 0.05). No significant difference was seen between 5-FU group and combination group with regard to the tumor volume, tumor mass, the inhibition rate, cell cycle changes, as well as Caspase-8 and Caspase-9 protein expression (> 0.05). In the 5-FU group, the level of albumin, total proteins, and blood cells were lower, while alanine aminotransferase level was higher, than that in the control group, GH group and combination group (< 0.05).In combination group, level of white blood cells was decreased compared with that in the control group and GH group (< 0.05).rhGH in combination with 5-FU does not affect the anti-cancer effect of 5-FU in the treatment of human gastric cancer in nude mice, but can improve the side-effect caused by 5-FU with regard to the blood parameters.

Recombinant human growth hormone; Fluorouracil; Gastric cancer; Transplanted tumor

DUAN Qi-wen, Email: duanqiwen@taihehospital.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.05.007

段奇文，Email：duanqiwen@taihehospital.com

2017-07-21