肺腺癌组织与血清中半胱氨酸双加氧酶1基因启动子区甲基化在早期肺癌诊断中的意义

陈晨，陆璨，陆前进

（1.中南大学湘雅二医院 胸外科，湖南 长沙 410011；2.中南大学湘雅医院 口腔医学中心，湖南 长沙 410008；3.医学表观基因组学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410011）

.论 著.

肺腺癌组织与血清中半胱氨酸双加氧酶1基因启动子区甲基化在早期肺癌诊断中的意义

陈晨1，陆璨2，陆前进3

（1.中南大学湘雅二医院 胸外科，湖南 长沙 410011；2.中南大学湘雅医院 口腔医学中心，湖南 长沙 410008；3.医学表观基因组学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410011）

目的 观察肺腺癌患者肿瘤组织和血清中半胱氨酸双加氧酶1（CDO1）启动子区甲基化状态，探索其与肺腺癌发生进展的关联，及CDO1基因甲基化作为肺腺癌血清学标记物的可能性。方法 收集早期肺腺癌患者和肺部良性肿瘤组织及血清样本，采用基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术，结合实时荧光定量PCR技术检测CDO1基因启动子区甲基化状态。结果 肺腺癌组织中CDO1基因甲基化检测率为71.4%（25/35），对应的血清检出率为51.4%（18/35）。对照组中CDO1基因甲基化率为10.0%（2/20），对应的血清检出率为5.0%（1/20），肿瘤组与对照组之间比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。从肺腺癌患者血清检测CDO1启动子区甲基化与从肿瘤组织中直接检测其结果具有很高的一致性（r =0.732，P ＜0.05）。结论 肺腺癌组织和血清DNA中存在CDO1基因启动子区的异常甲基化状态，且具有极高的特异性。血清游离DNA 的甲基化检测可能为肺腺癌的早期诊断、复发监测和预后判断提供全新的临床思路。

肺癌；甲基化；DNA；血清

肺癌是目前世界上最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率在男性肿瘤患者中居于第1位，在女性肿瘤患者中占第2位[1]。按照组织病理学分型肺癌可分为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）和小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC），其中NSCLC约占肺癌总发病率的90%。然而近年来随着生活方式、空气污染等因素的改变，肺腺癌的发病率呈逐年上升趋势，并逐渐成为中国最主要的肺癌类型[2]。肺腺癌的发病通常以周围型肺癌为主，早期无明显症状，转移率极高，预后很差。因此早期诊断对肺腺癌的治疗和预后至关重要。

半胱氨酸双加氧酶1（cysteine dioxygenase 1,CDO1）是一种金属蛋白酶，其主要功能是参与半胱氨酸的调节和牛磺酸合成。CDO1通常分布于细胞质中，由位于5q23.2的CDO1基因转录表达[3]。近年来研究发现，在结直肠癌、乳腺癌及脑胶质瘤中的发生过程中CDO1存在着表达失活，其启动子区高甲基化是导致基因功能异常的重要因素[4-6]。抑制CDO1基因启动子区高甲基化可以恢复CDO1的表达，抑制肿瘤细胞生长。由此认为CDO1具有肿瘤抑癌基因的功能。在对肺癌的研究中发现，NSCLC中存在着普遍的CDO1启动子区高甲基化现象，认为CDO1的甲基化对于NSCLC具有一定的特异性[7]。本研究通过观察肺腺癌患者肿瘤组织和血清中CDO1启动子区甲基化状态，探索其与肺腺癌发生进展的关联，及血清游离DNA中CDO1基因甲基化作为肺腺癌血清学标记物的可能性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

实验组临床标本取自2016年7月‐12月在本院胸外科首次接受手术治疗并确诊为早期肺腺癌的35例患者的肿瘤组织及血清样本。记录病例一般临床资料、病理分期，组织学分型等信息。所有患者术前均未接受任何放、化疗等其他治疗。对照组组织标本取自20例同时期接受手术治疗的肺良性肿瘤患者的组织和血清（错构瘤4 例，结核球10例，血管瘤2例，炎性假瘤4例）。实验组及对照组组织标本离体后立即置于液氮内保存备用。标本则在患者空腹12 h后于次日晨间抽取，高速离心机中3 000 r/min离心10 min，吸取上层血清，封装于2 ml冻存管中液氮内保存。本研究经过本院伦理委员会批准后实施，研究开始前受试者或其委托人已签署相关知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 DNA样本提取和亚硫酸氢钠修饰 为最大程度检测血清游离DNA中CDO1甲基化情况，课题组采用基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术[7-8]，简述如下：取血清样本1 ml，加入组织裂解液及蛋白酶K于55℃消化3 h后，加入磁珠（Promega公司），充分混匀后，直接采用磁珠抽提DNA；并采用Zymo公司EZ DNA Methylation kit直接在磁珠上对DNA进行亚硫酸氢钠修饰，最终获得可直接用于后续PCR扩增的DNA样本。

取肿瘤标本中心部位组织10 mg，加入适量液氮快速充分研磨至匀浆。加入组织裂解液及蛋白酶K过夜消化后，处理步骤同上。

1.2.2 甲基化特异性实时定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR） 扩 增 CDO1基因和内参基因β-actin，扩增引物由上海Invitrogen公司合成，具体引物序列如下：CDO1：上游引物5'-AGGCGGGGAGATTTTGCG-3'，下游 引 物：5'-CCTAAAACGCCGAAAACAACG-3'，探 针：CGGTTTACGCGTATATTTTCGGTTTT；β-actin： 上 游 引 物 5'-TAGGGAGTATAT AGGTTGGGGAAGTT-3'， 下 游 引 物：5'-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3'，探 针：CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGG AGGAGGTTTAGGCAGTCG。PCR反 应 体 系：10×PCR 缓 冲 液 2.5 μl；10 mmol/L dNTP混 合液 0.5 μl；50 mmol/L MgCl20.8 μl；Platinum Taq DNA 聚合酶 0.2 μl；上游及下游引物各 1 μl；2 μl修饰后的 DNA 模板；双蒸水 17 μl；总体积共25 μl。反应条件如下：95℃预变性5 min；94℃变 性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共循环45个周期；72℃终末延伸5 min。采用2-ΔCT法判断实时定量PCR阳性结果[7]。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。两组间均数的比较用独立样本t检验，组间比较采用χ2检验或Fisher's精确检验，采用Pearson法进行相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

表1示术前肿瘤组与对照组在年龄、性别上差异无统计学意义（P＞0.05）。

肺腺癌组织中CDO1基因甲基化检测率为71.4%（25/35），对应的血清检出率为51.4%（18/35）。对照组肺良性肿瘤中CDO1基因甲基化率为10.0%（2/20），对应的血清检出率为5.0%（1/20），肿瘤组与对照组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。提示CDO1启动子区甲基化对肺腺癌具有极高的特异性。此外，在肺腺癌组织中CDO1基因甲基化为阳性的25例患者中，对应的血清检出17例为甲基化阳性；而肺腺癌组织CDO1基因检测为阴性的10例患者中，只有1例在血清中检测出CDO1甲基化阳性。血清检测CDO1启动子区甲基化与从肿瘤组织中直接检测具有很高的一致性（r =0.732，P＜0.05）。

表1 CDO1基因甲基化与肺腺癌临床病理特征的关系

3 讨论

已有研究证实CDO1作为一种具有抑癌基因功能特征的基因，其基因启动子区高甲基化与食管鳞癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌等肿瘤的预后密切相关。研究认为半胱氨酸代谢途径在肿瘤细胞的侵袭过程中发挥着重要作用。CDO家族主要包括CDO1和CDO2两个成员[4-6]。CDO2是一种膜结合蛋白；CDO1是半胱氨酸分解代谢过程的关键酶，主要分布于细胞质中，其基因启动子区异常高甲基化引起基因表达下调，从而影响半胱氨酸代谢，细胞代谢异常，最终导致肿瘤的发生发展。

基于TCGA数据库分析发现，NSCLC中存在着广泛的CDO1启动子区域高甲基化，而在正常肺组织中这一情况则很少见[7]。本研究显示，实验组中CDO1基因启动子区甲基化发生率为71.4%（25/35），而对照组标本中仅为10.0%（2/20），这提示CDO1启动子区甲基化可能是肺腺癌发生发展的重要事件。

研究显示恶性肿瘤患者外周血中的游离DNA含量较高，这些小片段，半衰期短，极易降解的游离DNA多是由凋亡或坏死的肿瘤细胞释放而来。某些肿瘤特异改变的DNA片段在肿瘤细胞凋亡后会释放入循环血，如能够检测到这些特异性的基因异常，将极大地改善肿瘤的早期诊断和监测。目前已经可以从外周循环血中检测到肿瘤相关的基因突变，如EGFR，Kras等，然而DNA甲基化的检测则是一个难点。传统的亚硫酸氢钠修饰过程中会损失大量的DNA，这对于原本就很微量的循环血游离DNA检测而言，在很长时间里都是难以逾越的障碍。本研究采用的基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术，在亚硫酸氢钠修饰过程中最大程度减少了DNA的损失，并采用实时定量PCR技术检测DNA甲基化信号，极大地增强了检测的灵敏度和特异性[7-9]。本实验结果发现血清检测CDO1启动子区甲基化与直接从肿瘤组织中检测在结果上具有极高的一致性，这提示血清检测DNA中CDO1甲基化对肺癌进行诊断和监测是可行的。

综上所述，本研究发现肺腺癌组织和血清DNA中存在CDO1基因启动子区的异常甲基化状态，且具有极高的特异性。基于磁珠的DNA提取和亚硫酸氢钠修饰技术在血清游离DNA甲基化的检测中具有极高的灵敏度和实用性。血清游离DNA中CDO1的甲基化检测可能为肺腺癌的早期诊断、复发监测和预后判断提供全新的临床思路。

[1]Bray F, Jemal A, Grey N, et al. Global cancer transitions according to the Human Development Index (2008-2030): a population-based study[J]. The Lancet Oncology, 2012, 13(8): 790-801.

[2]Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China,2015[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2016, 66(2): 115-132.

[3]Brait M, Ling S, Nagpal JK, et al. Cysteine dioxygenase 1 is a tumor suppressor gene silenced by promoter methylation in multiple human cancers[J]. PloS one, 2012, 7(9): e44951.

[4]Yamashita K, Waraya M, Kim MS, et al. Detection of methylated CDO1 in plasma of colorectal cancer; a PCR study[J]. PloS one,2014, 9(12): e113546.

[5]Meller S, Zipfel L, Gevensleben H, et al. CDO1 promoter methylation is associated with gene silencing and is a prognostic biomarker for biochemical recurrence-free survival in prostate cancer patients[J]. Epigenetics, 2016, 11(12): 871-880.

[6]Dietrich D, Krispin M, Dietrich J, et al. CDO1 promoter methylation is a biomarker for outcome prediction of anthracycline treated,estrogen receptor-positive, lymph node-positive breast cancer patients[J]. BMC cancer, 2010, 10: 247.

[7]Hulbert A, Jusue-Torres I, Stark A, et al. Early detection of lung cancer using DNA promoter hypermethylation in plasma and sputum[J]. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research, 2017, 23(8):1998- 2005.

[8]Keeley B, Stark A, Pisanic TR, et al. Extraction and processing of circulating DNA from large sample volumes using methylation on beads for the detection of rare epigenetic events[J]. Clin Chim Acta,2013, 425: 169-175.

[9]Bailey VJ, Zhang Y, Keeley BP, et al. Single-tube analysis of DNA methylation with silica superparamagnetic beads. Clin chem, 2010,56(6): 1022-1025.

（胥洪娟 编辑）

Detection of cysteine dioxygenase 1 promoter hypermethylation in lung adenocarcinoma using tissue and serum samples

CHEN Chen1, LU Can2, LU Qianjin3
(1. Department of Thoracic Surgery, the Second Xiangya Hospital of Central South University, Changsha,Hunan 410011, China; 2. Department of Stomatology, Xiangya Hospital of Central South University, Changsha,Hunan 410008, China; 3. Hunan Key Laboratory of Medical Epigenomics, Changsha, Hunan 410011, China)

【Objective】To investigate the promoter methylation of cysteine dioxygenase 1 (CDO1) in tissue and serum sample from patients with lung adenocarcinoma.【Methods】Tumor tissue samples and serum samples were collected from 35 pathological con fi rmed lung adenocarcinoma patients and 20 lung benign tumor patients. Followed by real-time polymerase chain reaction, DNA extraction and bisulfite conversion were performed directly on magnetic beads.【Results】CDO1 methylation was detected in 71.4% of the tissue samples and in 51.4% of the serum samples from cancer group, whereas in 10% of the tissue samples and 5%of the serum samples in control group (P＜0.05). CDO1 promoter methylation detected in serum was consistent with that in tissuesamples (r=0.732,P＜0.05).【Conclusion】CDO1 methylation was detected in tumor and serum more frequently in people with cancer compared to controls. The detection of promoter methylation of CDO1 from serum samples may provide a new clue for the early diagnosis, monitoring, and prognosis evaluation of lung adenocarcinoma.

lung cancer; methylation; DNA; serum

R563.3

A

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.08.002

2017-06-10