超高效液相色谱-质谱联用检测土壤中两种抗生素呋喃唑酮和氟苯尼考

2017-11-06唐景春何若竹胡羽成

分析化学 2017年11期

南琼唐景春*,2,3 何若竹胡羽成吴涛

1(南开大学环境科学与工程学院，天津 300071)2(环境污染过程与基准教育部重点实验室，天津 300071)3(天津市城市环境污染诊断与修复技术工程中心，天津 300071) 4(天津市水利科学研究院，天津 300061)

南琼1唐景春*1,2,3何若竹1胡羽成4吴涛4

建立了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC/MS/MS)检测土壤中多种环境基质下呋喃唑酮和氟苯尼考的方法。提取液采用磷酸盐缓冲溶液(pH=3)-乙腈(3∶7，V/V)，经过SPE固相萃取小柱SAX-HLB串联富集，使用Waters BEH C18色谱柱(2.1×100 mm)进行分离，UPLC/MS/MS在多反应监测模式下进行定性与定量分析。以3倍信噪比确定方法检出限，以10倍信噪比确定方法定量限。结果表明，本方法在5 min内即可分离两种物质，呋喃唑酮和氟苯尼考的检出限分别为1.19和0.41 μg/kg; 定量限分别为3.40和1.37 μg/kg。50 μg/L加标水平的呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率分别为92%和79%; 200 μg/L加标水平下呋喃唑酮与氟苯尼考的回收率分别为96%和86%。

超高效液相色谱-串联质谱; 呋喃唑酮; 氟苯尼考; 固相萃取

2016-11-28收稿; 2017-09-04接受

本文系水体污染控制与治理科技重大专项(No. 2015ZX07203-011-06)、天津市水务局局科研项目(No. KY2015-01)和863成果转化项目(No. 14RCHZSF00144)资助

* E-mail: tangjch@nankai.edu.cn

1 引言

肉类、牛奶、蜂蜜和其它动物源性食物的抗生素残留对人类健康以及环境均存在不可忽视的风险。其中硝基呋喃类抗生素是常有的抗生素，由于其对人具有一定的毒副作用，许多国家已经禁止硝基呋喃类抗生素在农业生产中使用[1]。氯霉素(CAP)对人类具有潜在的致死作用，并且可以使人类容易患上诸如白血病、再生障碍性贫血和灰色婴儿综合征等疾病[2～4]。欧盟规定CAP在食品中的最高残留限量(MRPL)值为0.3 μg/kg[5]。硝基呋喃类抗生素的抗菌活性主要来源于5位碳上的硝基基团，其被广泛应用于奶牛的乳腺炎以及家禽家畜的鸡瘟、球虫病、猪肠炎的治疗[6～8]。1990年，日本首次将氟苯尼考用于渔业养殖中，韩国、美国以及欧洲的一些国家随后也开始使用氟苯尼考治疗鱼类疾病，1999年我国批准使用氟苯尼考[9～11]。由于呋喃唑酮(FZD)和氟苯尼考抗菌效果好，经常作为饲料直接喂养家禽以及鱼虾[12]，使用量日益增大，导致其环境残留也愈来愈多，造成抗生素污染。

目前，呋喃唑酮与氟苯尼考的检测方法主要有比色法、薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法等。Kaniou等[13]使用高效液相色谱-紫外-可见光二极管阵列方法检测了鸡蛋中的硝基呋喃类抗生素; Wilhelmus等[14]借助紫外可见光二级阵列管检测技术检测了卵中呋喃唑酮的含量，回收率为86%; Fernando等[15]使用高效液相色谱-二极管阵列检测器检测了组织结合的硝基呋喃类代谢物。然而，由于呋喃唑酮母体的复杂性、不稳定性以及其代谢产物的存在，使得高效液相色谱法检测呋喃唑酮的效果不佳，并且呋喃唑酮在动物体内代谢快，不稳定，难以长时间存留[14]，所以检测呋喃唑酮主要是通过检测呋喃唑酮的代谢物，但尚未见超高效液相色谱-串联质谱联用技术(UPLC-MS/MS)检测呋喃唑酮的方法。Cornejo等[16]使用液相色谱-串联级质谱联用方法检测了肉鸡羽毛中氟苯尼考含量; Ryan等[7]建立了液相色谱-质谱联用检测土壤中氟苯尼考的方法，回收率在60.2%120.3%之间; Lee等[17]开发了一种通过UPLC-MS/MS测定罗非鱼片中氟苯尼考残留及其代谢物氟苯尼考胺的方法; Orlando等[18]使用液相色谱-加热电喷雾离子化(HESI)和大气压化学电离(APCI)串联质谱对白尾鹿组织中氟苯尼考进行了定性和定量分析。谢恺舟等[19]使用高效液相色谱荧光检测法检测了鸡肉中的氟苯尼考，分离时间为18 min; 郭霞等[20]使用高效液相色谱法检测了鱼肉中的氟苯尼考，分离时间为22 min。目前使用UPLC-MS/MS检测土壤中的呋喃唑酮与氟苯尼考的方法鲜有报道。与HPLC相比，UPLC分析速度更快，分离能力更好，能够同时分离检测多种有机物质。本研究采用UPLC结合串联质谱技术检测土壤中的呋喃唑酮与氟苯尼考，不受复杂基质干扰，5 min内即可完全分离两种目标物，对土壤中的抗生素的检测有更广阔的应用前景。

2 材料与方法

2.1仪器与试剂

TYXH-I涡旋仪(中国上海豫明仪器有限公司); ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)、Xevo TQS超高效液相色谱质谱质谱联用仪(美国Waters公司);Lab-1A-50E冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司); 3H16RI高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司); SBEQ-CR1027固相萃取真空装置、DC12氮气浓缩仪、HLB固相萃取柱、SAX固相萃取柱(中国上海安普科技有限公司);XPE电子分析天平(梅特勒托利多仪器有限公司);PB-10精密pH计(赛多利斯科学仪器有限公司)。

氟苯尼考标准品(纯度99%)、呋喃唑酮标准品(纯度99%)购自Dr.Ehrenstorfer公司; 甲醇、乙腈(99.99%，HPLC级，上海安普科技有限公司); 其它试剂均为国产分析纯。实验用水为蒸馏水。

2.2实验方法

2.2.1标准储备液与工作液的配制标准储备液：称量0.01 g的氟苯尼考和呋喃唑酮，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 mg/L 标准储备液，20℃下保存。

标准工作液：取10 μL 1000 mg/L的氟苯尼考、呋喃唑酮标准储备液，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 μg/L的标准工作液。

配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0和200.0 μg/L系列氟苯尼考和呋喃唑酮混合标准溶液，用于绘制标准曲线。

磷酸盐缓冲溶液(pH=3.0， 4.6 g/L Na+)-乙腈(3∶7，V/V)(简称A液); EDTA-McIlvaine缓冲溶液(pH=4.0，柠檬素缓冲溶液-0.1 mol/L四乙酸二乙胺二钠，1∶1，V/V)-甲醇(1∶1，V/V)配制成EDTA-McIlvaine提取液(简称B液); 0.5 mol/L草酸-乙腈(1∶1，V/V，简称C液); 甲醇-柠檬酸缓冲溶液(pH=4.0)-EDTA溶液(3∶2∶1，V/V，pH 5．0，简称D液)。

2.2.2提取方法空白土壤样品经过冷冻干燥，研磨，过40目筛，备用。称取1 g备用空白土壤样品，添加氟苯尼考和呋喃唑酮标准工作储备液，使土壤中抗生素含量为50 μg/kg。称取经抗生素处理过的土壤1 g，加入0.2 g乙二胺四乙酸二钠， 10 mL A提取液，涡旋混合1 min，超声10 min， 8000 r/min离心15 min，上清液转移至另一个离心管中。再提取两次，合并上清液，用蒸馏水稀释至400 mL。串联SAX小柱与HLB小柱，先后用6 mL甲醇、6 mL蒸馏水活化、淋洗。400 mL提取稀释液经固相萃取小柱萃取，萃取完毕后用蒸馏水清洗固相萃取小柱，真空干燥30 min，弃去SAX小柱，仅留下富集有抗生素的HLB小柱。用甲醇洗脱HLB小柱，高纯氮气吹至尽干，用甲醇定容至1 mL，供UPLC-MS/MS检测。

2.3色谱分析条件

Waters BEH C18色谱柱，柱温50℃，流动相为0.5%甲酸(A)与乙腈(B)。流速0.4 mL/min，进样量10 μL，采用多反应监测模式，串联质谱检测。梯度洗脱程序: 0～1.5 min, 10% B; 1.5～2.0 min, 16% B; 2.0～2.5 min, 18% B; 2.5～3.0 min, 20% B; 3.0～4.0 min, 22% B; 4.0～5.5 min, 35% B; 4.5～6.5 min, 60% B; 6.5～7.0 min, 95% B; 7.0～10.0 min, 10% B，质谱条件见表1。

表1 质谱工作参数

Table 1 Mass spectrometric conditions for qualitative and quantitative analyses

抗生素Antibiotics离子化方式Ionizationmethod离子对Ionpair(m/z)锥孔电压Conevoltage(V)碰撞电压Fragmentorvoltage(V)呋喃唑酮Furazolidone(FZD)正离子模式Positiveionmode226．07/67．08/122．064620/22氟苯尼考Florfenicol(FFC)负离子模式Negativeionmode356．03/185．05/336．00188/8

图1 不同提取液对呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率A: 磷酸缓冲液/乙腈; B: EDTA-McIlvaine; C: 草酸/乙腈; D: 甲醇/柠檬酸缓冲溶液/EDTA溶液Fig.1 Recovery of furazolidone (FZD) and florfenicol (FFC) using different extraction solutionsA: Phosphate buffer-acetonitrile; B: EDTA-McIlvaine; C: oxalic acid-acetonitrile; D: methanol-citric acid buffer-EDTA.

3 结果与讨论

3.1提取液的选择

[21～23]方法，对比磷酸盐缓冲液-乙腈、EDTA-McIlvaine、草酸-乙腈、甲醇-柠檬酸缓冲溶液-EDTA溶液4种提取液，分别简称为A、B、C、D提取液。采用经检测不含有抗生素的土壤，制备成呋喃唑酮和氟苯尼考的浓度为50 μg/kg的土壤加标样品，采用4种提取液提取，A提取液对呋喃唑酮的氟苯尼考的提取效率最高，回收率分别达到96%和93%; B、 C、 D 3种提取液对呋喃唑酮的提取率较高，回收率在74%～91%之间，但是对氟苯尼考的回收率仅为47%～54%(图1)。综合考虑，选择A提取液对呋喃唑酮和氟苯尼考进行提取效果更好。李晓晶等[24]研究土壤中磺胺类提取效果时，也发现乙腈的提取效果优于甲醇; Pfenning等[21]认为这与乙腈良好的溶剂性能有关，也可能与提取液的pH值有关; 马丽丽等[25]研究表明，2%甲酸-乙腈溶液并不能有效提取氟喹诺酮类抗生素，50%乙腈-磷酸盐缓冲溶液对氟喹诺酮类抗生素回收率高于80%，这可能与氟喹诺酮类抗生素的pKa有关，在酸性条件下，氟喹诺酮类抗生素更加稳定。

3.2pH值对抗生素提取效果的影响

在不同的pH值条件下，抗生素的稳定性与存在形态不同。李晓晶等[24]在pH=3的酸性条件下提取四环素类抗生素; 而磺胺类抗生素在pH=5酸性条件下提取[26]。考察了提取呋喃唑酮和氟苯尼考的最优pH条件，每个样品设置3个平行样，提取液采用A液，使用0.1 mol/L NaOH调节pH值。由图2可见，随着pH值升高，回收率呈下降趋势，在pH=3.0时，呋喃唑酮的回收率为94%～97%，氟苯尼考的回收率为90%～93%。酸碱环境会影响抗生素的离子形态及稳定性，在碱性条件下,大部分抗生素容易碱性水解，而某些抗生素如红霉素在酸性条件下易酸解。呋喃唑酮与氟苯尼考为酸性化合物[14,15]，在酸性条件下更加稳定，在中性或者偏碱性条件下易水解，造成损失。

3.3HLB洗脱液体积对抗生素提取效果的影响

在确定最佳提取液和pH值后，进一步探究洗脱液体积对抗生素提取效果的影响。洗脱液为甲醇，考察甲醇体积为3、5、8和10 mL时的洗脱效果。结果如图3所示，随着甲醇洗脱液体积的增加，抗生素的回收率增加。相比之下，呋喃唑酮的提取效果更好，提取液体积为8与10 mL时，呋喃唑酮和氟苯尼考的提取回收率差异较小，因此确定洗脱液最佳体积为8 mL。

图2 不同pH条件下FZD和FFC回收率Fig.2 Recovery of FZD and FFC under different pH values

图3 HLB洗脱液体积对FZD和FFC回收率的影响Fig.3 Recovery of FZD and FFC with different volume of eluent

3.4线性范围及检出限

用甲醇将标准储液稀释成1000、500、250、100、50、25、10、5、1.0、0.5和0.1 μg/L目标物的混合标准系列浓度，根据每个浓度下的峰面积进行线性回归，根据3倍信噪比确定检出限，10倍信噪比确定定量限。表2为FZD和FFC的线性回归方程、相关系数、检出限与定量限。

表2 方法的线性范围、相关系数、检出限、定量限

Table 2 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of the proposed method

抗生素Antibiotics回归方程Regressionequation线性范围Linearityrange(μg/kg)相关系数Correlationcoefficient(R2)检出限LOD(μg/kg)定量限LOQ(μg/kg)FZDy=2210．7x+559．70．1～10000．99971．193．40FFCy=180．1x-170．80．1～10000．99970．411．37

在优化的实验条件下，呋喃唑酮和氟苯尼考被很好地分离检测，图4为呋喃唑酮、氟苯尼考的二级质谱图，图5为分离色谱图。可见，本方法能够很好地分离复杂基质中多组分物质。

图4 呋喃唑酮(A)和氟苯尼考(B)的二级质谱图Fig.4 Mass spectra (MS2) of (A) FZD and (B) FFC

3.5方法回收率

采用2.2.2实验方法检测加标水平为50和200 μg/kg呋喃唑酮和氟苯尼考的土壤样品，每个样品平行测定3次，两个加标浓度下的呋喃唑酮与氟苯尼考的回收率见表3。

图5 呋喃唑酮与氟苯尼考分离色谱图Fig.5 Separation chromatogram of FZD and FFC

表3 FZD, FFC的回收率

Table 3 Recovery (n=3) of FZD and FFC

抗生素Antibiotics加标量Added50μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)200μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)FZD9210．39612．3FFC795．68615．1

3.6实际样品分析

对华北地区某水库底泥的37个采样点进行呋喃唑酮和氟苯尼考含量检测，呋喃唑酮含量在5.0～330.2 μg/kg，平均值为73.2 μg/kg。氟苯尼考含量在0～4.5 μg/kg范围内，平均值为0.7 μg/kg。其中呋喃唑酮检出率为100%，污染比较严重; 氟苯尼考检出率73%，但检出量均较低，多在0.5 μg/kg左右，表明此地区氟苯尼考污染风险较小。

4 结论

建立了一种UPLC/MS/MS检测底泥中呋喃唑酮和氟苯尼考的方法，采用磷酸盐缓冲液-乙腈(3∶7，V/V)提取，在酸性条件(pH=3)下,呋喃唑酮和氟苯尼考的提取效果更好，洗脱液为8 mL甲醇，本方法前处理步骤简单，检测速度快，回收率高。本研究为UPLC-MS/MS方法检测各种复杂基质中抗生素残留以及有机物质的分析检测提供了参考。

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DeterminationofFurazolidoneandFlorfenicolinSoilbyUltraPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

NAN Qiong1, TANG Jing-Chun*1,2,3, HE Ruo-Zhu1, HU Yu-Cheng4, WU Tao4
1(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)2(KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteria,MinistryofEducation,Tianjin300071,China)3(TianjinEngineeringCenterofEnvironmentalDiagnosisandContaminationRemediation,Tianjin300071,China)4(TianjinHydranlicResearchInsitute,Tianjin300061,China)

A detection method for furazolidone and florfenicol in soil with various environmental matrices was established using ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry (UPLC/MS/MS) technique. Extracting solution of a mixture of phosphate buffer (pH=3) and acetonitrile (3∶7,V/V) was used in this experiment. The extracted water samples were enriched by SAX-HLB solid phase extraction column before the process of nitrogen blowing (high purity nitrogen). The enriched antibiotics were desalted with 8 mL of methanol. Waters BEH C18(2.1 × 100 mm) column was used for the sample separation. UPLC/MS/MS was carried out for qualitative and quantitative analysis under multi-reaction monitoring mode. The detection limit of the method was determined by 3 times of signal-to-noise ratio, and the limit of determination of the method was determined by 10 times of signal-to-noise ratio. The results showed that the detection limits of furazolidone and florfenicol were 1.19 and 0.41 μg/kg, respectively, and the limits of quantitation of furazolidone and florfenicol were 3.40 and 1.37 μg/kg, respectively. Besides, recovery experiment showed that, for the soil samples spiked with 50 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 79% for florfenicol and 92% for furazolidone. Similarly, for the soil samples spiked with 200 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 96% for furazolidone and 86% for florfenicol.

Ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry; Furazolidone; Florfenicol; Solid phase extraction

28 November 2016; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.160870