乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌的关联性及危险因素分析

薛伟红 王友春 韩宏锋 李志宾 杨 静

乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌的关联性及危险因素分析

薛伟红 王友春 韩宏锋 李志宾 杨 静

目的研究乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌间关联性，并对危险因素探讨。方法慢性乙型肝炎病毒感染患者220例，其中慢性乙肝小三阳64例(小三阳组)，慢性乙型肝炎大三阳62例(大三阳组)，慢性乙型肝炎肝硬化50例(肝硬化组)，乙型肝炎相关原发性肝癌44例(原发性肝癌组)。观察4组乙肝病毒DNA不同含量(采用乙型肝炎病毒检测试剂盒检测)患者分布情况及表达水平；采用PCR扩增方法检测4组患者乙肝病毒DNA含量，采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验测定乙肝表面抗原。结果4组患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，小三阳组DNA不同含量患者分布与大三阳组、肝硬化组、原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。小三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于大三阳组、肝硬化组和原发性肝癌组，差异有统计学意义(P<0.05)，大三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于肝硬化组，差异有统计学意义(q=3.884，P<0.05)。4组患者乙肝表面抗原水平差异有统计学意义(P<0.05)，小三阳组与大三阳、肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，大三阳组与肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。原发性肝癌组5～15年、>15年吸烟率，>15年饮酒率高于肝硬化组，不良饮食、e抗原阳性发生率高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢性乙肝小三阳、大三阳、肝硬化、原发性肝癌中，乙型肝炎病毒DNA水平和乙肝表面抗原呈下降趋势，长期吸烟、饮酒，不良饮食习惯和e抗原阳性是原发性肝癌发病的危险因素。

乙型肝炎病毒；肝肿瘤；危险因素

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1489～1493)

原发性肝癌位居全球癌症死亡原因第2位，在亚太地区相关死亡中位居第3位，男性原发性肝癌的发病率显著高于女性，在亚太地区，慢性乙型肝炎仍然是除日本外亚太主要国家原发性肝癌的主要发病原因[1-2]。全球疾病负担表明了慢性乙型肝炎病毒感染的高发病率和高死亡率，尽管过去有所减少[3]。虽然我国对原发性肝癌预防实施了改善风险因素和有效筛查，但乙型肝炎发病率仍比较高，增加了原发性肝癌引起的病死率[4]。本研究对乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌间关联性分析及危险因素探讨，以期对临床和预防工作提供借鉴。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2016年9月在我院住院治疗的慢性乙型肝炎病毒感染患者220例，其中男性160例，女性60例；年龄35～63岁，平均年龄(54.2±6.8)岁；其中慢性乙肝小三阳64例(小三阳组)，慢性乙型肝炎大三阳62例(大三阳组)，慢性乙型肝炎肝硬化50例(肝硬化组)，乙型肝炎相关原发性肝癌44例(原发性肝癌组)。4组患者一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 4组患者一般资料比较

注：*为χ2值，#为F值。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准：①患者均符合“慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)”[5]相关诊断标准；②年龄≥30岁；③患者和(或)家属知情同意，签署知情同意书。排除标准：①药物性、代谢性、自身免疫性肝病；②其他类型病毒感染性肝炎、肝硬化或相关性肝癌；③继发性肝癌；④近期使用免疫抑制剂、生物制剂等治疗的患者；⑤患者和(或)家属不同意进行相关研究。

1.3 方法

1.3.1 乙肝病毒DNA含量检测 采用乙型肝炎病毒(DNA)检测试剂盒(厦门海菲生物技术有限公司)。抽取患者清晨空腹肘静脉血2 ml，置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中，取分离出的血清0.2 ml送检。血清标本在2 ℃～8 ℃可放置72 h，-70 ℃可长期保存，标本不宜反复冻融。①标本、对照品的处理和加样：血清标本、试剂盒内阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照各取50 μl(冻存血清或对照品使用前在室温融解，振荡混匀10 s)，分别加入50 μl核酸提取液，振荡10 s，99 ℃干浴或水浴10 min，13 000 r/min离心10 min，保留上清备用。处理后的样品应在3 h内使用，或在-20 ℃～-80 ℃最长保存1个月(不宜反复冻融)。②DNA标准品进行10、100、1000倍梯度稀释：取N×36 μl混合液与N×0.4 μl酶(Taq+UNG)混匀(N为反应管数)，3 000 r/min离心10 s，取36.4 μl上述PCR反应混合液于适当容量离心管中，然后将样品、阳性对照、阴性对照、YVDD对照、YIDD对照处理上清液和梯度稀释的HBV DNA标准品各4 μl分别加入离心管中，立即进行PCR扩增反应。③PCR扩增：离心管置于定量荧光PCR仪上，ABI7000、MJ-II、ABI7900循环参数设置：37 ℃×2 min，94 ℃×2 min；再按93 ℃×15 s→60 ℃×60 s，循环40次；荧光检测在60 ℃，反应体系为40 μl，HBV DNA定量检测选用FAM通道。④将定量标准品及各稀释度拷贝数浓度输入仪器软件中。

1.3.2 乙肝表面抗原检测 采用人乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(蓝图生物科技有限公司)。采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验进行测定。抽取患者清晨空腹肘静脉血2 ml，使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，4 000 rpm条件下离心20 min，小心地分离出血清，保存在-20 ℃以下，避免反复冻融。有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。①按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。②从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。③设置标准品孔、样本孔和空白孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50 μL。④样本孔加待测样本50 μL。⑤除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体50 μL。⑥用封板膜盖住反应板，37 ℃水浴锅或恒温箱温育120 min。⑦揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30 s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。⑧将底物A和B按1∶1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100 μL。用封板膜盖住反应板，37 ℃水浴锅或恒温箱温育15 min。⑨所有孔加入终止液50 μL，在酶标仪上读取各孔吸光度(OD值)。

1.4 观察指标

①观察4组乙肝病毒DNA不同含量患者分布情况及表达水平；②观察4组患者乙肝表面抗原水平，并进行相关性分析；③收集肝硬化组和肝癌组的临床资料，对吸烟、饮酒、不良饮食习惯、e抗原阳性等危险因素进行分析。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 4组乙肝病毒DNA不同含量患者表达水平比较

4组患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比较差异有统计学意义(Hc=83.203，P<0.05)，小三阳组DNA不同含量患者分布与大三阳组、肝硬化组、原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(χ2值分别为39.044、99.663和50.243，P<0.05)，其余3组比较，差异无统计学意义(χ2值分别为7.038、2.100和1.102，P>0.05)。小三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于大三阳组、肝硬化组和原发性肝癌组，差异有统计学意义(q值分别为16.297、19.136和16.616，P<0.05)，大三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于肝硬化组，差异有统计学意义(q=3.884，P<0.05)，原发性肝癌组乙肝病毒DNA表达水平与大三阳组、肝硬化组比较，差异无统计学意义(q值分别为1.896、1.750，P>0.05)。见表2。

表2 4组乙肝病毒DNA不同含量患者分布情况及表达水平比较(例，%)

2.2 4组患者乙肝表面抗原水平比较

4组患者乙肝表面抗原水平差异有统计学意义(P<0.05)，小三阳组与大三阳组、肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(q值分别为56.787，125.644、123.697，P<0.05)，大三阳组与肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(q值分别为71.527、71.557，P<0.05)，原发性肝癌组与肝硬化组比较，差异无统计学意义(q=2.4662，P>0.05)，见表3、图1。

表3 4组患者乙肝表面抗原水平比较

图1 4组患者乙肝表面抗原水平分布图

2.3 肝硬化组和原发性肝癌组危险因素分析

原发性肝癌组5～15年、>15年吸烟率，>15年饮酒率高于肝硬化组，不良饮食、e抗原阳性发生率高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 肝硬化组和原发性肝癌组危险因素分析(例，%)

3 讨论

肝细胞癌是人类主要死亡原因之一，而乙型肝炎病毒是世界上肝癌最常见的病因，尤其在亚洲、非洲、东欧和中欧南部乙型肝炎病毒流行的地区表现尤为突出[6-10]。芝加哥-美国临床肿瘤学会年会上公布的研究结果显示，与丙肝患者相比，乙肝患者更易在较年轻时发展为肝癌，且多为侵袭性、低分化肿瘤，往往生长较快，门静脉血栓形成，肿瘤大于5 cm，50%以上癌症在肝脏，α甲胎蛋白较高和诊断时即为晚期[11]。因此研究乙型肝炎病毒感染与原发性肝癌间的关系及危险因素十分重要。

血清中乙肝病毒DNA水平是乙肝病毒复制的可靠定量指标，患者的病毒载量会随时间的推移而变化，这取决于患者的年龄和感染“阶段”，如处于"活动"期的患者，病毒载量升高，表现出肝损害症状，此类患者需要治疗[12-15]。Bell等[16]对186位免疫活性较高的乙型肝炎患者进行研究发现，38位患者进行了肝脏活检，22位谷丙转氨酶超过正常上限2倍的患者中有12位、18位乙肝DNA>20 000 IU/mL的患者中有11位中重度肝炎或纤维化，说明HBV DNA升高增加晚期肝纤维化风险。本研究发现，4组患者乙肝病毒DNA不同含量患者分布比较差异有统计学意义(P<0.05)，小三阳组DNA不同含量患者分布与大三阳组、肝硬化组、原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。小三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于大三阳组、肝硬化组和原发性肝癌组，差异有统计学意义(P<0.05)，大三阳组乙肝病毒DNA表达水平高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明慢性乙型肝炎病毒DNA水平并不是判定乙型肝炎肝脏相关疾病进展的标准，但可以作为辅助手段判定乙型肝炎病毒相关性肝癌的传染性，但不能直接反应病情进展情况。

血清中乙肝表面抗原定量检测的意义在于，它不仅反应了病毒与宿主免疫应答的平衡，同时乙肝表面抗原的水平也取决于cccDNA转录能力；此外，乙肝表面抗原水平的升高还标志着新的感染或再发，乙肝表面抗原水平的降低意味着T淋巴细胞的活力起作用[17-19]。对于非活动期的HBV携带者而言，乙肝表面抗原水平可以作为1个附加的工具，将e抗原阴性、肝功能正常的但却有高复发风险的人群与非活动期的携带者区分开来。Tseng等[19]对2 688 例B或C基因型慢性HBV感染但非肝硬化初治患者进行研究发现，e抗原阳性、高水平HBV DNA以及高水平丙氨酸转氨酶均与原发性肝癌高发病率相关，同时研究还发现，HBsAg水平与原发性肝细胞癌风险具有量效相关性。本研究发现，4组患者乙肝表面抗原水平差异有统计学意义(P<0.05)，小三阳组与大三阳、肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，大三阳组与肝硬化组和原发性肝癌组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，原发性肝癌组与肝硬化组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，原发性肝癌组5～15年、>15年吸烟率，>15年饮酒率高于肝硬化组，不良饮食、e抗原阳性发生率高于肝硬化组，差异有统计学意义(P<0.05)。这与上述研究结果相近。同时Chien等[20]研究发现，诊断肝硬化时年龄较大、HBeAg 阳性、rs671 AA/AG 基因型、ALT、AFP和HBsAg水平升高是慢性乙型肝炎肝硬化患者发生肝癌的风险预测因素。

综上所述，慢性乙肝小三阳、大三阳、肝硬化、原发性肝癌中，乙型肝炎病毒DNA水平和乙肝表面抗原呈下降趋势，长期吸烟、饮酒，不良饮食习惯和e抗原阳性是原发性肝癌发病的危险因素。

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(编辑：吴小红)

CorrelationofHepatitisBVirusInfectionandPrimaryLiverCancerandRiskFactors

XUEWeihong，WANGYouchun，HANHongfeng，etal.

LuoyangCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity，Luoyang，471000

ObjectiveTo study the relationship between hepatitis B virus infection and primary liver cancer，and to explore the risk factors.Methods220 patients with chronic hepatitis B virus infection were selected，including 64 cases of chronic hepatitis(positive group)，62 cases of chronic hepatitis B HBeAg(HBeAg positive group)，50 cases of chronic hepatitis B cirrhosis(cirrhosis group)，44 cases of hepatitis B primary hepatocellular carcinoma(PHC).PCR amplification method was used to detect hepatitis B virus DNA content of the 4 groups，and DAS-ELISA was used to detect hepatitis B surface antigen.ResultsDistribution of patients with different hepatitis B virus DNA content of the 4 groups had statistically significant difference(P<0.05)，Distribution of patients with different hepatitis B virus DNA content of positive group and the other groups had statistically significant difference(P<0.05).Hepatitis B virus DNA expression level of positive group was higher than the other groups，the difference was statistically significant(P<0.05)，the expression level of hepatitis B virus DNA of HBeAg positive group was higher than cirrhosis group，the difference was statistically significant(q=3.884，P<0.05).The difference was statistically significant in hepatitis B surface antigen levels among the 4 groups(P<0.05)，positive group and the other groups had statistically significant difference(P<0.05)，HBeAg positive group and liver cirrhosis group and HCC group had statistically significant difference(P<0.05).The rate of smoking was 5 years and >15 years in the primary liver cancer group，and the drinking rate was higher in the >15 group than that in the liver cirrhosis group.The incidence of adverse diet and e antigen was higher than that of the liver cirrhosis group，the difference was statistically significant(P<0.05).ConclusionIn chronic hepatitis，HBeAg，cirrhosis，hepatocellular carcinoma，hepatitis B virus DNA and hepatitis B surface antigen gradually decrease，long-term smoking，drinking，unhealthy eating habits and e antigen are risk factors of primary liver cancer.

Hepatitis B virus；Liver neoplasms；Risk factors

471000 郑州大学附属洛阳中心医院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.028

R735.7

A

1001-5930(2017)09-1489-05

2017-04-05

2017-06-12)