长非编码RNA(lncRNA)与乳腺癌多药耐药患者放疗敏感性的相关性

邱 杨 张怀文 骆 萍 钟晓鸣

长非编码RNA(lncRNA)与乳腺癌多药耐药患者放疗敏感性的相关性

邱 杨 张怀文 骆 萍 钟晓鸣

目的探究长非编码RNA与乳腺癌多药耐药患者放疗敏感性的相关性。方法BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7共5种人乳腺癌细胞株，采用细胞梯度照光细胞克隆实验检测5种细胞株的存活分数(SF)。采用高通量lncRNA芯片筛选BS517、BS524、BS525-1590细胞株表达量较高的lncRNA，并分析lncRNA与放疗抵抗性的相关性。结果各细胞经梯度照光后，各细胞株的SF值大小排列(由大到小)依次为BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，该顺序同样由高到低地反映出各细胞株对放疗的敏感性；R05532、NR-015441、NR-033374 3种lncRNA在细胞系中表达明显较高；R05532、NR-015441、NR-033374 3种lncRNA的表达水平与细胞放疗抵抗性呈正相关，其γ值分别为0.931、0.926、0.928，且P<0.05；AA745020的表达水平与细胞放疗抵抗性无明显的相关性，γ=0.416，P>0.05。结论R05532、NR-015441、NR-033374 3种lncRNA在人乳腺癌细胞中高表达，且当其高表达时呈现的放疗抵抗性最高，这3种lncRNA高表达时可作为放疗抵抗的预测分子。

乳腺癌；长链非编码RNA；放疗敏感性；高通量lncRNA

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1416～1419)

目前治疗乳腺癌主要手段是手术、放疗和化疗，由于乳腺癌组织与周围组织的粘连固定等原因，目前放疗已成治疗的主要手段，经放疗可提高手术的切除率，并降低其复发率。然而患者对术前放疗的敏感性不同，因此放疗效果也不尽相同[1-4]。人类约有90%RNA不具备编码蛋白质的功能，且有1/3的基因受到非编码RNA的调控。长链非编码RNA(lncRNA)可以参与调控上游分子，能够在表观遗传学、转录调控和转录后调控3个方面对基因进行调节。相关研究表明，lncRNA对于放疗相关的信号通路及效应分子的调控具有重大意义，因此筛查对放疗敏感的lncRNA对提高放疗疗效意义深远[5-7]。本研究采用lncRNA芯片筛选放疗敏感的lncRNA，检测其在不同人乳腺癌细胞株的表达量，并分析其与放疗的抵抗关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人乳腺癌细胞株BS517(MDA-MB-435S)、BS524(T47D)、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7均购自中国科学院上海细胞生物研究所；RNA提取试剂盒Trizol购自美国Invitrogen生物公司；荧光定量SYBR Green和反转录试剂盒购自TaKaRa公司；实时定量PCR引物由上海Invitrogen合成。实验仪器：ABI Real Time PCR扩增仪；6 MV直线加速器(美国Varian)；LightCycle(Roche Diagonstics公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 复苏人乳腺癌细胞株BS517(MDA-MB-435S)、BS524(T47D)、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。培养基：10%FBS+1% 100×青链霉素溶液+DMEM，于细胞生长期进行实验。

1.2.2 细胞放疗敏感性检测 采用医用6 MV直线加速器(美国Varian)检测细胞放疗敏感性，将1.5 cm等效蜡板置于细胞培养瓶上，源波距100 cm，设置Gy剂量照光梯度为0、2、4、6、8，剂量率为400 cGy/min。克隆形成率(PE)=克隆数/接种细胞数×100%，细胞存活分数(SF)=照射组PE/对照组PE×100%。每组实验均重复3次取平均值。

1.2.3 lncRNA 芯片的制备 提取BS517、BS524、BS525-1590放疗敏感性差异大的细胞株RNA制备cDNA样本。采用高通量lncRNA芯片(美国Arraystar公司)，于标准条件下，将标记好的探针和高密度基因组芯片杂交，采用芯片扫描仪(Gene Pix)检测芯片荧光强度。

1.2.4 lncRNA的筛选 选取表达量较高的lncRNA，再经UCSC基因数据库对序列进行排查，确定4条序列全长明确的非编码RNA，分别为R05532(chr8:114557150-115165825)、NR-015441(chr16:2653385-26804095)、NR-033374(chr9:130873450-130881013)、AA745020(chr8:114557150-115165825)。

1.2.5 实时定量PCR提取 BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7的RNA，特异性转录lncRNA为cDNA，采用实时定量PCR检测细胞lncRNA的表达水平，检测条件：95 ℃ 5 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，循环数40。采用GAPDH作为内参，引物序列如下：R05532：上游：5’GCATAGGATGTGCCAACAA3’，下游：5’GTGACCTGAAGTTCCCCATT-3’；NR-033374：上游：5’GCTGGGATTACAGGTGTGAG3’，下游5’CAAAGGTTCGTGGTGGTT3’；NR-033374：上游5’CCCATTCGGTTGCTGAGTAG3’，下游5’TCACAGAGGCTTCATTTGTAA 3’；AA745020：上游5’ CCAAGGTTTCCGAAGACAAT3’，下游5’ AGGGTGATGCCAGGTTCTA3’；GAPDH：上游5’ GGGAAACTGTGGCCTGAT3’，下游5’GAGTGGGTGTCGCTGTTGA3’。采用2-△△CT计算RNA相对表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各细胞株对放疗敏感性的检测

各细胞经梯度照光后，各细胞株的SF值根据大小排列(由大到小)依次为BS517(0.82±0.02)、BS524(0.67±0.01)、BS525-1590(0.59±0.03)、SKBR-3(0.42±0.01)、MCF-7(0.030±0.01)，该顺序同样由高到低地反映出各细胞株对放疗的敏感性。

2.2 各细胞株表达lncRNA水平的比较

所有实验数据均经3次重复取平均值所得。实验结果显示，R05532、NR-015441、NR-033374 3种lncRNA在细胞系中表达明显较高。见表1，图1～3。

表1 各细胞株表达lncRNA水平的比较

2.3 lncRNA与细胞放疗抵抗的关系

细胞放疗抵抗性与R05532、NR-015441、NR-033374 的lncRNA表达水平呈正相关，其γ值分别为0.931、0.926、0.928，且P<0.05；与AA745020的表达水平无相关性，γ=0.416，P>0.05。见图4。

图1 各细胞株中RO5532相对表达量

图2 各细胞株中NR-05441相对表达量

图3 各细胞株中NR-033374相对表达量

图4 各细胞株与放疗抵抗性的关系

3 讨论

在手术治疗乳腺癌前，多采用放疗进行辅助治疗，如果患者对放疗敏感性较高，则放疗可以有效降低肿瘤体积，提高手术的切除率，同时降低复发率，显著延长患者的生存期。如果患者对放疗敏感性较低，则放疗作用不明显，手术治疗的难度大大增加，术后复发的几率也随之提高。因此，患者对放疗的个体差异显著影响治疗的成功率，如何提高患者对放疗的敏感性是目前研究的主要目标。

lncRNA是位于真核细胞中的非编码RNA，研究发现，在哺乳动物的基因组序列中，有4%～9%是非编码RNA，其量大大超过编码RNA。虽然非编码RNA不能够转录翻译成蛋白质，但是其具有重要的生物学意义。lncRNA能够参与X染色体的沉默、基因组印记、修饰染色质，对于编码基因的转录激活、转录干扰及核内运输都具有重要的作用。此外，lncRNA内部含有类似于启动子的关键序列，具有更为敏感的结构和功能，同时具备顺式调控作用和反式调控作用。但是目前大多数lncRNA的调控作用尚不清楚，但是诸多的研究表明，lncRNA参与了机体的生长发育、细胞分化、细胞凋亡等生理和病理过程，并在其中扮演着重要的调控作用[8]。且相关报道表明lncRNA与肿瘤的关系密切，其可以调控DNA损伤的应答通路，DNA损伤应答使得肿瘤细胞在活性氧、化疗、电离辐射等条件下保持基因组的完整，因此DNA损伤应答是抗肿瘤的阻碍[9-10]。据此，我们推测，lncRNA可能参与放疗敏感性的调节。本研究采用lncRNA芯片筛选放疗敏感的lncRNA，检测其在不同人乳腺癌细胞株的表达量，并分析不同lncRNA的表达和放疗敏感性的相关性。实验结果显示，各细胞经梯度照光后，检测各细胞株的SF值，根据SF值的大小排列(由大到小)依次为BS517、BS524、BS525-1590、SKBR-3、MCF-7，该顺序同样由高到底地反映出各细胞株对放疗的敏感性；R05532、NR-015441、NR-0333743种lncRNA在细胞系中表达明显较高；R05532、NR-015441、NR-0333743种lncRNA的表达水平与细胞放疗抵抗性呈正相关，其γ值分别为0.931、0.926、0.928，且P<0.05；AA745020的表达水平与细胞放疗抵抗性无明显的相关性，γ=0.416，P>0.05。

综上所述，lncRNA确实和放疗敏感性相关，且其表达量和放疗抵抗呈正相关，因此可作为放疗敏感性的预测因子，为今后的放疗提供参考。

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(编辑：甘艳)

CorrelationbetweenLongNoncodingRNA(lncRNA)andRadiotherapySensitivityinMultidrugResistantBreastCancerPatients

QIUYang,ZHANGHuaiwen,LUOPing,etal.

JiangxiCancerHospital,Nanchang，330029

ObjectiveTo study the correlation between long noncoding RNA (lncRNA) and radiotherapy sensitivity of multidrug resistance in breast cancer.Methods5 kinds of human breast cancer cell lines of BS517,BS524,BS525-1590,SKBR-3 and MCF-7 were used to detect the survival fraction (SF) by cell gradient photographers.Long noncoding RNA (lncRNA) with high expression of BS517,BS524 and BS525-1590 were screened by high-throughput lncRNA chip,and the correlation between lncRNA and radiotherapy resistance was analyzed.ResultsAfter the cells were irradiated with gradient,the SF values of each cell line were in the order of BS517,BS524,BS525-1590,SKBR-3 and MCF-7,which was also reflected resistance to radio-therapy from high to low.The expression of 3 kinds of lncRNA likes R05532,NR-015441,NR-031374 in the cell lines was significantly higher than others.The expression levels of R05532,NR-015441 and NR-033374 were positively correlated with the radiotherapy resistance (γ=0.931，γ=0.926,γ=0.928),(P<0.05).There was no significant correlation between AA745020 expression level and cell radioactivity resistance,γ=0.416,P>0.05.ConclusionThree kinds of lncRNA such as R05532,NR-015441 and NR-033374 are highly expressed in human breast cancer cells and have the highest resistance to radiotherapy when they are highly expressed.These 3 genes can be used as predictors of radiation resistance.

Breast cancer;Long noncoding RNA;Radiotherapy sensitivity;High-throughput lncRNA

330029 江西省肿瘤医院(邱 杨，张怀文，钟晓鸣)；330009 江西省南昌市第三医院(骆 萍)

钟晓鸣

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.006

R737.9

A

1001-5930(2017)09-1416-04

2016-09-22

2017-03-09)