乳腺癌组织中P38、VEGF表达与其淋巴结转移及预后的关系

陆 清 梁宏莉 江 科 夏亚琳 薛晓红

乳腺癌组织中P38、VEGF表达与其淋巴结转移及预后的关系

陆 清 梁宏莉 江 科 夏亚琳 薛晓红

目的探讨乳腺癌组织中P38、VEGF表达与其淋巴结转移及预后的关系。方法选取经病理证实为乳腺癌患者88例为研究对象。采用SP法检测P38、VEGF蛋白在乳腺癌组织中的表达，应用COX回归模型，探讨P38、VEGF表达与乳腺癌预后的关系。结果88例患者中P38阳性表达67例，阴性21例；VEGF阳性56例 阴性32例。所有患者均随访到2016年1月31日，以死亡或肿瘤转移、复发为终点事件，出现终点事件的患者17例；P38、VEGF在Ⅲ期乳腺癌组织中表达水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期，而与患者年龄、肿瘤大小无明显相关性。复发及转移患者中P38、VEGF阳性率明显高于无转移和复发者，差异显著，具有统计学意义，P<0.05；多因素分析提示：肿瘤分期(P=0.01)、P38阳性(P=0.001)、VEGF阳性(P=0.02)是乳腺癌患者转移或复发的独立危险因素。结论P38、VEGF阳性表达患者的转移及复发率高，P38、VEGF阳性是患者转移及复发的独立风险因素。

乳腺癌；复发；转移

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1398～1400)

恶性肿瘤特征之一是细胞自主持续地分裂与繁殖。近年，越来越多的学者认为肿瘤是一种细胞周期疾病[1]。有关细胞周期增生调控的分子机制研究证实相关蛋白可以反映多种人体肿瘤中细胞增殖状态的标志物[2]。分裂原活化蛋白激酶(MAPK)是细胞内参与细胞生长、分化的主要信息传递系统，与肿瘤的发生密切相关，P38是MAPK家族的重要成员，已有研究证实P38在乳腺癌组织中表达明显高于正常组织[3-4]。血管内皮细胞生长因子(VEGF)是促进血管生成的重要原因之一，在多种肿瘤的发生、发展及转移、复发过程中发挥重要作用。已有临床研究证实，VEGF在乳腺癌患者早期即可呈阳性[5]。本研究分析我院88例乳腺癌患者病理活检时乳腺癌组织中P38、VEGF蛋白的表达水平，探讨P38、VEGF蛋白的表达水平与患者转移及复发的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取本院2009年1月至2011年1月收治并经病理证实为乳腺癌的患者88例为研究对象，入选标准：①经病理组织学活检确诊为乳腺癌；②患者及家属均同意进行，既往未接受化疗及放疗等抗癌治疗；③术前行全身检查排除远处转移。排除标准：①合并严重心血管系统疾病、肝肾功能不全的患者；②精神异常患者；③合并其他肿瘤的患者；④严重免疫功能缺陷。年龄35～65岁，平均(59.7±8.5)岁，体重43～62 kg，平均(52.3±3.5 )kg；收集患者临床资料，记录可能影响患者肿瘤分期、年龄、肿瘤大小、转移例数、复发例数，所有患者均随访到2016年1月31日，以死亡或肿瘤转移、复发为终点事件。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂

兔抗人P38多克隆抗体及VEGF兔多克隆抗体购自Cell Signaling 公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗、S-P超敏免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。

1.3 P38、VEGF免疫组织化学染色及检测

采用SP法检测乳腺癌组织中P38、VEGF表达：组织标本以10%甲醛液固定24 h，常规石蜡包埋，制备5 μm厚连续切片，贴附于涂有APES处理的载玻片上，60 ℃烤片2 h。免疫组织化学染色：①石蜡切片脱蜡至水；②3%H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min；③微波抗原修复；④5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育10 min，倾去血清，分别滴加P38、VEGF-抗工作液，37 ℃孵育1～2 h，PBS冲洗，5 min×3次。⑤滴加生物素标记的二抗，37 ℃孵育20～30 min，PBS冲洗，5 min/次，共3次。⑥滴加辣根酶标记链酶卵白素，37 ℃孵育20～30 min，PBS冲洗，5 min/次，共3次。⑦DAB显色；⑧自来水充分冲洗、复染、封片。用已知阳性标本作阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。阳性结果呈棕黄色或棕褐色颗粒，不同生物学指标在细胞中的着色部位不同。每张切片随机取3个高倍视野，以阳性细胞比例的平均值定义为该肿瘤的阳性细胞百分比。

1.4 随访

所有患者每隔3个月进行随访，以死亡或肿瘤转移、复发为终点事件，最后一次随访时间为2016年1月30日。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 一般资料

88例患者，P38阳性表达67例，阴性21例；VEGF阳性56例 阴性32例。所有患者均随访到2016年1月31日，以死亡或肿瘤转移、复发为终点事件，出现终点事件的患者17例。

2.2 P38、VEGF表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移及复发的关系

P38、VEGF在Ⅲ期乳腺癌组织中表达水平明显高于Ⅰ、Ⅱ期，而其与患者年龄、肿瘤大小无明显相关性。复发及转移患者中P38、VEGF阳性率明显高于无转移和复发者，差异显著，P<0.05，见表1。

表1 P38、VEGF表达与乳腺癌临床分期、淋巴结转移和复发的关系/例

2.3 P38、VEGF表达与患者转移和复发的关系

17例复发者中，P38、VEGF阳性率明显高于未复发者。将性别、年龄、肿瘤大学、肿瘤分期、P38、VEGF水平等作为变量引入Cox回归模型，单因素分析提示：术前肿瘤分期(P=0.02)、P38阳性(P=0.03)、VEGF阳性(P=0.001)与乳腺癌患者转移复发密切相关，具体见表2，多因素分析提示：肿瘤分期(P=0.01)、P38阳性(P=0.001)、VEGF阳性(P=0.02)是乳腺癌患者转移或复发的独立危险因素，具体见表3。

表2 影响乳腺癌患者转移或复发的单因素分析

表3 影响乳腺癌患者转移或复发的多因素分析

3 讨论

乳腺癌是妇女常见恶性肿瘤之一，近年，乳腺癌发病率和死亡率逐年上升。肿瘤的浸润和转移是肿瘤治疗的最大障碍和直接导致患者死亡的主要原因。学者提出肿瘤需要突破血管再生调控抑制因子与刺激因子作用的平衡，进而达到从血管前期的静止状态发展到伴随肿瘤血管新生的浸润状态[6]。

肿瘤新生血管为肿瘤细胞与个体的血管循环系统直接相通，是恶性肿瘤发生远处转移播散的必要条件。血管新生与实体瘤的生长、浸润、转移及预后密切相关，血管生成最重要的正性调控因子是血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子[7]。新生的血管不仅提供肿瘤血供，而且增加肿瘤转移率。VEGF作为血管生成的主要调控因子，特异性地作用与血管内皮细胞，进而促进细胞有丝分裂，增加毛细血管通透性，最终促进肿瘤生长。相关研究发现，VEGF与肿瘤分期、大小呈正相关[8]。

P38是由360个氨基酸构成的分子量为38KDa的蛋白质，是MAPK家族的重要成员。多种刺激因子使P38苏氨酸和络氨酸双磷酸化，激活P38,使其进入细胞核，调节转录因子的活性，影响细胞内多种基因的转录、蛋白合成及细胞表面受体表达和细胞骨架结构改变，在细胞迁移、肿瘤侵袭和转移方面具有重要的调控功能[9]。临床研究发现P38与乳腺癌临床分期、淋巴结转移有关，提示P38MAPK信号传导途径可能在乳腺癌的侵袭与转移中起着重要作用[10-12]。

本研究结果显示P38、VEGF在Ⅲ期乳腺癌组织中表达明显高于Ⅰ、Ⅱ期，而与患者年龄、肿瘤大小无明显相关性。复发及转移患者中P38、VEGF阳性率明显高于无转移和复发者，差异显著，具有统计学意义，P<0.05；多因素分析提示：肿瘤分期(P=0.01)、P38阳性(P=0.001)、VEGF阳性(P=0.02)是乳腺癌患者转移或复发的独立危险因素。提示我们P38、VEGF阳性表达患者的转移及复发率高，P38、VEGF阳性是患者转移及复发的独立风险因素。其他类似研究结果显示VEGF及P38MAPK表达与人类多种恶性肿瘤发生发展及侵袭转移之间具有相关性，并且发现VEGF在人类鳞状细胞癌中的上调是通过P38MAPK介导的。乳腺癌患者各种生长因子等细胞外信号作用于肿瘤细胞膜上的受体，将信号转导至细胞内，使P38MAPK磷酸化，促进VEGF蛋白表达并向肿瘤细胞外分泌，促进淋巴管内皮细胞增生，从而增加癌细胞进入淋巴管密度，促进淋巴结转移[13-15]。

[1] 唐 莉,葛梦圆,韦 达,等.Hsa-miR-145调控Rab GTP酶家族成员27A基因对乳腺癌细胞株MDA-MB-231迁移和侵袭的影响〔J〕.中华实验外科杂志,2014,31(9):1929-1932.

[2] 韩艳春,刘鲁英,张 骞,等.乳腺癌组织中VEGF-C和p38MAPK的表达及与伴淋巴结转移的关系〔J〕.中国组织化学与细胞化学杂志,2013,22(1):20-24.

[3] 韩艳春,张 骞,董孟华,等.乳腺癌中磷酸化p38和MMP-7的表达〔J〕.临床与实验病理学杂志,2014,30(7):732-735.

[4] 安淑香,孙硼朋,龙振海,等.p-p38和SIAH2在乳腺浸润性导管癌中表达的意义〔J〕.中国血液流变学杂志,2014,(1):149-152.

[5] 黄 芳.VEGF和CA153表达水平与乳腺癌疾病进展的关系〔J〕.国际检验医学杂志,2013,34(2):147-148.

[6] 张聚良,姚 青,陈江浩,等.CD147 siRNA对乳腺癌细胞HIF-1α、MMP-2与VEGF表达及细胞凋亡的影响〔J〕.现代肿瘤医学,2013,21(2):247-249.

[7] 韩中保,戴小丽,韩扣兰,等.NF-κB、 HER-2和VEGF-C在乳腺癌组织中的表达及相关性分析〔J〕.重庆医学,2013,42(18):2080-2082.

[8] 陈文有,周 松,刘 静,等.乳腺癌VEGF-C的表达与淋巴结转移及预后的关系〔J〕.现代肿瘤医学,2013,21(3):533-535.

[9] 杨德华,王明军,于龙飞,等.p16/p38 MAPK/p53/Wip1通路在乳腺癌发生、发展中的作用及其临床意义〔J〕.中华实验外科杂志,2010,27(8):1086-1087.

[10] 王 睿,李照青,宋 敏,等.整合素β3,p38MAPK及MMP-2在乳腺癌中存在功能性的联系〔J〕.解剖科学进展,2011,17(2):108-112.

[11] 韩艳春,曾宪旭,王 睿,等.p38MAPK信号通路与uPA在乳腺癌细胞及组织中表达的相关性〔J〕.癌症,2007,26(1):48-53.

[12] 唐 勇,王 辉,陈伟娟,等.EMT经p38-MAPK调节乳腺癌MCF-7细胞P-gp介导的多药耐药〔J〕.中国肿瘤生物治疗杂志,2010,17(2):144-148.

[13] 李志刚,马 辉,黄桂林,等.乳腺癌外周血中VEGF-C与癌组织中C-erbB-2蛋白的表达及临床意义〔J〕.石河子大学学报(自然科学版),2008,26(3):338-341.

[14] 许志杰,王诚铨,谢亚锋,等.乳腺癌组织中COX-2、VEGF-C表达与淋巴转移的相关性研究〔J〕.国际外科学杂志,2008,35(8):521-524.

[15] 李栢林,韩 硕,李 凤,等.p38信号蛋白在乳腺癌组织中表达的研究〔J〕.中国老年学杂志,2006,26(3):346-349.

(编辑：吴小红)

RelationshipbetweenExpressionofP38,VEGFinBreastCancerandLymphNodeMetastasisandPrognosis

LUQing,LIANGHongli,JIANGKe,etal.

YueyangHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shanghai,200437

ObjectiveTo investigate the relationship between expression of P38,VEGF in breast cancer and lymph node metastasis and prognosis.Methods88 cases of patients with breast cancer confirmed by pathology were selected as the research objects.SP method was used to detect p38,VEGF protein expression in breast carcinoma tissues and to investigate the protein expression levels and breast cancer metastasis and recurrence effect,Cox regression model was used to explore the relationship between p38,VEGF expression and breast cancer prognosis.ResultsAmong 88 cases,P38 positive expression in 67 cases,negative in 21 cases,VEGF positive expression in 56 cases and negative in 32 cases.All patients were followed up to January 31,2016,to death or tumor metastasis and recurrence as the endpoint,17 patients had endpoint events;p38 and VEGF expression in stage Ⅲ breast cancer tissues was significantly higher than that in stage Ⅰ and Ⅱ,and had no significant correlation with age and tumor size.P38 and VEGF positive rates in patients with recurrence and metastasis were significantly higher than patients without metastasis and recurrence,there had statistical difference (P<0.05).Multivariate analysis showed that tumor staging (P=0.01),p38 positive (P=0.001),VEGF positive (P=0.02) were independent risk factors for metastasis and recurrence of breast cancer.ConclusionMetastasis and recurrence rates of patients with P38,VEGF positive expression are high,P38 and VEGF positive expression are independent risk factors for metastasis and recurrence.

Breast cancer;Recurrence;Metastasis

上海市教育委员会(编号：2015YSN44)；上海市科学技术委员会(编号：14401933200)

200437 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院

薛晓红

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.002

R737.9

A

1001-5930(2017)09-1398-03

2016-06-07

2017-01-12)