探讨利用测量不确定度评估ELISA法检测抗HEV-IgM实验中灰区设置的适用性

杨宇生

（成都市疾病预防控制中心，四川 成都 610041）

探讨利用测量不确定度评估ELISA法检测抗HEV-IgM实验中灰区设置的适用性

杨宇生

（成都市疾病预防控制中心，四川 成都 610041）

目的 探讨ELISA法检测HEV-IgM的实验中灰区值的设置。方法 使用瑞士汉密尔顿全自动酶联免疫分析仪FAME24/20检测HEV-IgM，利用本实验室ELISA法检测抗HEV-IgM实验中的测量不确定度，评估ELISA法检测抗HEV-IgM实验中灰区值的范围。结果置信水平为95%时，抗HEV-IgM扩展不确定度U抗HEV-IgM=59.78%，在临界状态下，即s/co=1时，s/co值有95%的可能性位于1± 1*59.78%，即可评估ELISA法检测抗HEV-IgM实验中灰区值范围为0.40～1.60。结论 灰区范围的设置能显著的影响到ELISA检测结果，设置合理的符合实验室实际情况的灰区范围，有助于降低假阴性标本的漏检率，提高检测的准确度和检测质量，利用实验室已获得的测量不确定度来评估检测项目的灰区范围，比起按照固定比例来设置灰区范围更为科学合理，也更适合不同实验室的实际情况。

ELISA；测量不确定度；灰区；设置

戊型病毒性肝炎是一种经消化道传播的病毒性肝炎，其传播方式、临床表现和预后均与甲型病毒性肝炎类似，是发展中国家的面临的一个重大公共卫生问题，能引起戊型肝炎大的爆发流行或急性散发性感染，还可转为慢性感染，主要侵犯中青年，尤其是孕妇感染率高，戊肝如果爆发在孕妇人群尤其是妊娠晚期，易导致高发病率、高病死率、高急性肝功能衰竭等肝脏疾病，还可导致早产儿，低出生体质量儿和围生期病死率的风险增加[1]。《中华人民共和国食品安全法》（2015年修订）第45条中也规定，患有国务院卫生行政部门规定的有碍食品安全疾病的人员，不得从事接触直接入口食品的生产。从事接触直接入口食品工作的食品生产经营人员应当每年进行健康检查，取得健康证明后方可上岗工作。而戊型病毒性肝炎作为食品从业人员健康检查的项目之一，是卫生行政部门规定的有碍食品安全疾病之一。

血清免疫学检测抗HEV-IgM作为戊肝近期感染的标志[1]，其中ELISA法是最常用的免疫学检测方法之一。酶联免疫试验（ELISA）法是免疫诊断中的一项常用技术，已成功地应用于多种病原微生物引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断，也可应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定。由于ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定以及易于自动化操作等特点，还广泛应用于各级医疗卫生机构，如各级医院，疾病预防控制中心实验室，采供血机构实验室等，因此保证ELISA检测结果的准确性和检测质量，对于疾病的诊断，预防筛查和流行病学调查等有着十分重要的意义。但是由于ELISA法影响因素较多，十分有必要在临界值附近设置灰区，以提高检测准确性，避免出现漏检。同时，由于国内试剂厂商多没有提供试剂检测结果的灰区值，国内对于灰区范围的设置没有统一的标准，各实验室对于灰区设置也有不同的观点和方法。基于此，本研究对此问题进行初步探讨，尝试利用实验室的测量不确定度来评估ELISA检测中实验项目的灰区的范围设置。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器：预防医学门诊部实验室采用瑞士HANMILTON AT全自动样本处理机，和瑞士汉密尔顿FAME24/20全自动酶联免疫分析仪。

1.1.2 试剂：北京万泰生物药业有限责任公司生产的抗HEV-IgM酶联免疫体外诊断试剂盒，北京康彻思坦生物制剂公司生产的室内质控品（单位：抗HEV-IgM，2 U/mL），卫生部临床检验中心提供的室间质量评价考核标本（每次质评活动中提供5个水平的质评样本）。

1.2 数据：室内质控根据操作手册每一检测批内进行一次检测，收集本实验室2015年4月至2016年4月万泰抗-HEV-IgM（批号：201501001）共83个质控数据。收集2014年至2015年度卫生部临床检验中心的室间质量评价活动，抗HEV-IgM实验项目全年共两次室间质评结果，每次室间质评活动中，卫生部临床检验中心发出5组水平的质控样本，尽量选择检测结果在临界值附近（s/co值在1～6）的质控样本的室间质评数据。

1.3 检测程序：①确保仪器处于良好的性能，仪器按作业指导书进行维护，年底由厂家工程师做年终维护；②以实验室程序文件为指导，正确开展实验室室内质量控制，同时每年参加卫生部临床检验中心组织的免疫项目室间质量评价计划，均通过；③实验室室内质控品和卫生部临检中心室间质评样本的测量过程，均和日常常规标本一致，根据仪器作业指导书和试剂说明书严格进行操作。

1.4 不确定度的来源与计算

1.4.1 不确定度来源：近年来国外学会诺德创新中心（NordicInnovation）提出一整套规则，即Nordtest准则[2]，其主要致力于北欧国家检测方法的发展和检测的一致性评定，以保证北欧国家间产品与服务能无障碍的流通，其中有关测量不确定度的评定方法主要采用实验室已有的室内质控数据和实验室参加PT（能力验证）计划所获得的室间质量评价数据来进行测量不确定度的评估，旨在提供一个实用的、易于理解的、普遍的测量不确定度的评定方法，即是说，实验室如果拥有室内质控数据，并参加了实验室能力验证计划并获得反馈回的室间质量评价数据，就可以根据Nordtest准则来进行测量不确定度的评估。根据Nordtest准则[2]，测量不确定度主要来源于实验室内重现性（Reproducibility within-laboratory），以及方法和实验室偏倚（Method and laboratory bias）。

1.4.2 不确定度评定[2-4]：合成相对标准不确定度uc（y）和扩展不确定度U：

U=k×uc，其中包含因子k=2，取95%置信区间。

其中，①实验室内重现性（Rw）主要反映的是实验室内的精密度，因此当室内质控品经过和常规检测样本一致的实验处理过程并具有相似的基体效应时，室内质控数据的变异系数CV就是实验室内重现性（Rw）的相对标准不确定度，用uRw（rel）表示：

在本文中s为本实验室1年内室内质控数据标准差， 为1年内室内质控数据平均值。

②方法和实验室偏倚即均方根（Root mean square，RMS），计算公式为[3]

n为实验室参加卫生部临床检验中心室间质评的实验次数，bias为实验室室间质评样本测量值与质评样本公示值之间的相对偏倚值。

③参考值和（或）参考方法偏倚ucref，根据ISO13528[4]：

cvr为室间质评中相同方法组所得检测结果的变异系数，m为室间质评相同方法组中参评实验室的数目，1.25为稳健标准差的转换系数。

2 结 果

2.1 uRw（rel）计算结果：收集本实验室2014年至2015年度的同一批号的室内质控数据，利用室内质控数据来评估测量不确定度，结果见表1。

表1 实验室内重现性的相对标准不确定度

2.2 相对偏倚和RMSbias计算结果：收集本实验室2014年至2015年度卫生部临检中心室间质量评价回馈数据，评价方法和实验室偏倚的测量不确定度，结果见表2。

表2 评价方法和实验室偏倚相对标准不确定度

2.3 参考值测量不确定度ucref计算结果：结果见表3。

表3 室间质评参考值相对标准不确定度

2.4 合成相对标准测量不确定度和扩展不确定度：

其中包含因子k=2，取95%置信区间。

2.5 ELISA法检测抗HEV-IgM灰区范围：置信水平为95%时，抗HEV-IgM扩展不确定度U抗HEV-IgM=59.78%，在临界状态下，即s/co=1时，s/co值有95%的可能性位于1±1*59.78%，即可评估本实验室ELISA法检测抗HEV-IgM实验中灰区值范围为0.40～1.60。

3 讨 论

ELISA法的基本原理是抗原抗体的特异性结合，以及底物和酶的多级放大系统，其操作步骤复杂，每一步操作不当都会对最终结果产生影响，同时ELISA法影响因素众多，包括试剂的因素，样本前处理，内源性和外源性干扰因素等[5]。在采用ELISA方法进行检测时，国产试剂常以CUTOFF值（co值）来作为判定检测结果阳性还是阴性的标准，但是由于ELISA方法学的原因和种种限制，还是会出现一些处于临界值附近的结果，现有的实验室技术难以判断其阴阳性，而国外的ELISA试剂通常把这一区间的结果定义为“灰区”[6]。由此可以看出，由于ELISA方法学的固有特性和局限性，其必然会存在有处于“灰区”范围内的可疑检测结果，同时由于ELISA法步骤复杂，影响因素众多，因此应用ELISA法进行检测时变异系数较大，灰区的范围相对较宽，因此科学合理的设置灰区范围对实验结果和检测质量有着显著影响。

灰区的设置就是在临界值附近划出一定的“范围”，在这个“范围”内样本的检测结果为“可疑”，需对样本进行重复检测，设置灰区范围的方法一般有两种，一是根据室内质控的变异系数cv，或室内质控的标准差SD[7]，另一种是按照固定比例来设定，例如10%～15%倍CUTOFF值区域作为灰区范围[8]。笔者认为酶联免疫实验（ELISA）中“灰区”的设置不是固定的，也没有一个统一的标准比例，由于ELISA实验影响因素众多，同时每个检测项目的特点不同，各个实验室的客观条件、检测水平也各不相同，因此“灰区”范围的设定应该根据不同检测项目，不同检测条件，由各实验室根据实际情况进行设置，毛瑞[9]也持相似的观点，同时仅仅根据室内质控cv或SD来设置，也存在一定局限，如cv仅反应实验室批内和批间变异，未能反应出实验室检测的偏倚大小，而根据Nordtest准则[2]，测量不确定度主要来源于实验室内重现性、以及方法和实验室偏倚，其能全面反应实验室的批内和批间变异，以及实验室的偏倚。测量不确定度是表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相联系的参数，即在一定的置信水平下，测量之值有多大可能性处于这个区间。当ELISA检测结果在判断结果真伪的临界值，即s/co=1时，由于检测的测量不确定度的存在，此检测结果有一定的可能性（一般是95%可信水平），处于1± 1*U，从而可以评估出该检测项目实验中的灰区值范围，因此笔者认为利用测量不确定度来评估灰区范围较为科学、合理。

陈善华[6]等的研究表明，ELISA检测HBsAg结果处于灰区范围的样本，经电化学发光和HBA DNA重复检测，其阳性率达10%以上，因此灰区范围合理、科学的设置，有利于帮助判断“可疑”标本，从而采取不同检测试剂，或者不同检测方法进行复检，以进一步减少漏检的可能性，提高实验室检测质量，保证广大群众的健康。

[1] 肖培,程龙慧,许晓红.戊型肝炎病毒研究进展[J].现代预防医学, 2014,41(22):4160-4162.

[2] Magnusson B,Naykki T,Hovind H,et al.Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental laboratories[S]. Espoo:Nordtest,2003.

[3] Bertil Magnusson,Haakan Ossowicki,Olaf Rienitz Elvar Theodorsson.Routine internal-and external-quality control data in clinical laboratories for estimating measurement and diagnostic uncertainty using GUM principles[J].Scand J Clin Lab Invest, 2012,72(3):212-220.

[4] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.利用实验室间比对进行能力验证的统计方法[S].北京:中国标准出版社,2012.

[5] 容莹,孙秀双,郑望春,等.乙型肝炎表面抗原检测结果分析及灰区设置探讨[J].检验医学与临床,2010,7(15):1593-1595.

[6] 陈善华,朱丽莉,李浩,等.ELISA方法检测HBsAg设置灰区的必要性探讨[J].中国输血杂志,2013,26(10):1013-1014.

[7] 魏兰华.ELISA法检测抗-HIV实验中灰区设置的探讨[J].临床输血与检验,2015,17(6):566,581.

[8] 伍伟建,郭如华.ELISA试验灰区设置方法的探讨[J].中国生物制品学杂志,2008,21(10):911-912.

[9] 毛瑞.西藏自治区血液中心实验室酶联免疫吸附试验检测“灰区范围”浅谈[J].实用医技杂志,2013,20(3):285-287.

Discuss the Applicability of Using Measurement Uncertainty to Assess the Setting of Gray Area in Anti-HEV-IgM Detection by ELISA

YANG Yu-sheng
(Chengdu Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China）

Objective Discuss the setting of gray area in anti-HEV-IgM detection by ELISA. Methods Use the Automatic enzyme-linked immunity analyzer FAME24/20 to detect anti-HEV-IgM, make use of measurement uncertainty in anti-HEV-IgM by ELISA, assess the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA. Results With a 95% confidence level, the expanded uncertainty of anti-HEV-IgM was 59.31%, at the CUT-OFF level(S/CO=1), there was a 95% chance that S/CO was between 1±1*59.31%, then the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA was 0.41-1.59. Conclusion The setting of gray area observably affects the detection of ELISA, reasonable range of gray area coincide with the actual situation of lab, helps to decrease the not-detected rate of false negative,improves the accurancy and quality of detection, assessment of the gray area range by the lab’ measurement uncertainty obtained, was more reasonable than setting of gray area by fixed ratio, then more suitable to the actual situation of the lab.

ELISA; Measurement uncertainty; Gray area; Setting

R575.1

B

1671-8194（2017）18-0011-03