甲醇超声溶解-HPLC法测定蜂胶黄酮类化合物含量

陈 文,王湘君,李凌燕, 王玉杰,黄宇志, 钱 明,赵秀志,孟凡猛

(海南热带海洋学院 a.海洋科学技术学院; b.生命科学与生态学院,海南 三亚 572022)

甲醇超声溶解-HPLC法测定蜂胶黄酮类化合物含量

陈 文a,王湘君b,李凌燕a, 王玉杰b,黄宇志a, 钱 明a,赵秀志a,孟凡猛a

(海南热带海洋学院 a.海洋科学技术学院; b.生命科学与生态学院,海南 三亚 572022)

为优化五指山蜂胶测定黄酮类化合物实验条件,研究运用甲醇溶剂超声溶解浸出法处理蜂胶样品,除去蜂胶中的蜂蜡及脂溶性杂质;辅以高效液相色谱(HPLC)法,以甲醇-0.4%磷酸(55/45,V/V)为流动相,在检测波长为270～360 nm条件下,测定蜂胶中7种黄酮类化合物含量;结果发现甲醇溶剂超声溶解浸出法处理样品操作简单快捷,与常规分析方法相比,HPLC法测定简便快速,回收率高,检出限低,精密度高,受干扰影响小,准确性好.结论:五指山蜂胶黄酮类化合物的含量均在国家标准含量范围内,且该测定方法令人满意.

五指山;蜂胶;超声溶解; HPLC;黄酮类

0 引言

五指山蜂胶是一种天然、安全、具有多种生物活性的物质,化学成分非常丰富,含有大量黄酮类化合物,被誉为“紫色黄金”[1].国内专家对蜂胶研究的领域也非常广泛,张翠平等[2]介绍了蜂胶中所含的黄酮类物质的种类;李帅[3]得出了对蜂胶中黄酮类化合物的最佳提取工艺方法,并对提取蜂胶总黄酮进行分离纯化,对纯化后的蜂胶黄酮提取物进行抗氧化和抑菌功效的研究,找到了各类分离纯化方法的最佳条件;焦月华[4]等总结了多种物质总黄酮类化合物的提取及提纯方法,为蜂胶中黄酮类化合物检测提供了校好的方法参考;各国科学工作者对蜂胶的化学成分进行了大量研究,Mohammadzadeh等[5]对伊朗德黑兰的蜂胶进行TMCS衍生化后,经GC-MS检测,主要化合物为短叶松素、短叶松素-3-乙酸酯、松属素、球松素、柯因和高良姜素,其化学组成表明,该蜂胶是典型的杨树型蜂胶,并从蜂蜜中鉴定出7种异黄酮类化合物[6]

1 材料与方法

1.1材料与仪器

五指山原生态蜂胶;芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素、高良姜素(广州市齐云生物科技有限公司)、甲醇(色谱纯)、磷酸(分析纯)和超纯水(娃哈哈纯净水);高氯酸G.R.(天津市科密欧化学试剂有限公司);硝酸G.R.(洛阳昊华化学试剂开发中心);氢氟酸G.R.(天津市科密欧化学试剂开发中心);盐酸G.R.(郑州派尼化学试剂厂);所用玻璃器皿等均用5%硝酸溶液浸泡24 h以上.

AB104-S万分位天平,瑞士Mettler Toledo公司;岛津LC-2010A高效液相色谱仪,包括紫外检测器、二元泵、在线脱气机和自动进样器;JU-6224型超声发生器,上海杰恩普超声设备有限公司;岛津TU-1901双光束紫外分光光度计;容量瓶:25 mL,50 mL,100 mL,1000 mL,吸量管:0.5 mL,2 mL,5 mL,10 mL,常用的玻璃仪器等.

1.2 实验方法

1.2.1样品前处理

样品前处理先采用甲醇溶剂超声溶解浸出法;后采用岛津LC-2010A高效液相色谱仪进行检测.

1.2.2甲醇溶剂超声溶解浸出法

称取试样0.5000 g(精确至0.0001 g)4份置于小烧杯中,分别用9 mL甲醇超声溶解,加入6 mL 0.1% 甲酸,用JU-6224型超声发生器溶解,再用甲醇定容于50 mL容量瓶中备用,见表1.

表1 甲醇溶剂超声溶解条件的比较

甲醇超声微波溶解的蜂胶样品溶液所测出的图谱中检出峰更明显,基线更加平稳.因此,选择温度28℃、功率240W、保留时间10 min作为本次试验的样品前处理方法.

1.3检测条件

1.3.1紫外分光光度计法

将各标准对照样品溶液及蜂胶样品溶液在TU-1901双光束紫外分光光度计光谱进行预扫描,发现各标准对照样品溶液及蜂胶样品中黄酮类化合物的紫外吸收波长均在270 nm、360 nm之间.

1.3.2 HPLC法

根据紫外可见分光光度计光谱预扫描曲线显示的数值,实验中7种黄酮类化合物标准对照品溶液及蜂胶样品溶液在波长为270 nm和360 nm处均有吸收峰.为进一步确定HPLC色谱条件,分别在270 nm和360 nm波长下对紫外可见分光光度计光谱中所用蜂胶样品溶液进行检测,确定最佳检测波长,如图1.

图1 蜂胶标准对照品溶液及蜂胶样液HPLC图谱(数据1:270 nm,数据2:360 nm)

通过对蜂胶样品溶液、标准对照品溶液的紫外分光光度计的检测以及HPLC在相应波长下的检测发现,波长在270 nm下蜂胶样品溶液和标准对照品溶液的检出峰峰型完整、紧凑,容易观察,检测波长定位于270 nm波长处.

1.3.3检测方法的确定

实验的结果发现,最佳前处理方法为甲醇溶剂超声溶解法,条件为温度28℃、功率240W、保留时间10 min;检测波长为270 nm.

1.4样品的检测

1.4.1色谱条件

色谱柱:Inertsil ODS-3(150×4.6 mm,5 μm),柱温:38℃；流动相:甲醇和0.4%磷酸(二者比例55:45),流速1 mL/min,进样量10 μL；检测波长270 nm.

1.4.2样品制备

称取试样0.5000 g(精确至0.0001 g),置于50 mL三角瓶中,分别用9 mL甲醇超声溶解,加入6 m L 0.4% 磷酸,用CW-2000超声微波协同萃取仪在温度28℃、功率240W、保留时间10 min的条件下溶解,再用甲醇定容,用0.45 μm 滤膜过滤,制得样品溶液.

2 结果与讨论

2.1标准曲线的绘制

称取芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素和高良姜素标准对照品1.0 mg,分别置于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,摇匀制得标准溶液.分别取4 mL芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、乔松素标准对照品溶液,10 mL山萘酚标准对照品溶液,15 mL高良姜素标准对照品溶液于50 mL容量瓶中,用甲醇定容,制得混合标准溶液;分别取芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素和高良姜素标准液,使用超纯水配制成浓度为20 μg/mL的母液;再分别量取母液,并分别稀释至浓度为0.00、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00 μg/mL,每种标准品的浓度C(μg/ mL)为横坐标,峰面积A为纵坐标绘制标准曲线;得回归方程,并计算其相关系数R2,见表2.

表2 7种黄酮类化合物标准溶液曲线及相关系数

数据及曲线图表明,线性范围在0～6.00 μg/mL内,线性方程相关系数R2在0.9997以上.

2.2 HPLC谱图

2.2.1定性分析谱图

根据各检出峰的出峰时间,确定所含物质是否相同,即蜂胶样品溶液中所含物质出峰时间与标准对照品溶液出峰时间相同,在270 nm波长下对每种标准对照品溶液及蜂胶样品溶液进行进样扫描,光谱图如下.

HPLC光谱图显示,蜂胶样品溶液中芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素、高良姜素出峰时间分别是4.9、10.1、6.2、14.8、12.4、23.1、34.2 min,与标准品基本一致.

2.2.2标准对照品混合液HPLC谱图

由于实验中选用的流动相对标准对照品混合液物质分离的效果不佳,检出峰较少,且不规则,即采用单个标准对照品溶液进行对照分析,标准对照品混合液HPLC光谱图见图10.

2.3蜂胶样品溶液中各黄酮类化合物含量

采用高效液相色谱法(HPLC)法来测定五指山蜂胶中黄酮类化合物芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素、高良姜素的含量.实验结果见表3.

表3 蜂胶样品测量结果 n=6

实验数据表明,五指山蜂胶中黄酮类化合物总含量为82.680 mg/g,占样品总量的8.2%,其中芦丁所占总黄酮最多,含量为15.280 mg/g.

2.4结果准确度分析

为保证实验数据的可靠性与真实性,减少实验误差,确保实验结果更加准确,研究分别进行精密度实验、方法检出限实验和加标回收率实验,进一步检验研究结论的可信度.

2.4.1精密度实验

精密度(precision)系指用该法选择同一匀质样品在相同条件下重新进行实验,记录测量值.比较彼此符合的程度[7-9].两组测量值相比较越接近则越精密,常用标准(偏)差(standard deviation,SD或S);相对标准(偏)差(relative standard deviation,RSD),也称变异系数(coefficient of variation,CV),分析时,常用RSD表示精密度;现分别取芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素和高良姜素浓度为1.0 μg/mL的标准液,在特定仪器工作参数下进行测定3次,并根据测定的浓度结果计算其标准偏差,结果见表4.

表4 黄酮类化合物精密度实验

计算结果显示各物质相对标准偏差均在0.2%以下,仪器精密度较高.

2.4.2方法检出限

检出限是评价一个分析方法及测试仪器性能的重要指标,是指某一特定分析方法,在给定的显著性水平内,可以定性地从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量;所谓“检出”是指定性检出,在检出限附近不能进行准确的定量[10-13];现将蜂胶的空白样品测定10次,依据公式DL=3SD/S,S为校准曲线斜率[14-15],计算出黄酮类化合物检出限,结果见表5.

表5方法检出限测定结果(n=10)

黄酮类化合物平均空白标准标准偏差斜率检出限芦丁0.263848.730.00092962槲皮素0.264776.540.00101959杨梅素0.055782.640.00209816芹菜素0.262645.760.00040619山萘酚0.350370.590.00213332乔松素0.261541.400.00144625高良姜素0.262370.5900.00212094

由方法检出现测定结果可知检出限在0.002之内,结果较好.

2.4.3加标回收实验

加标回收实验分为样品加标回收和空白加标回收.实验采用的是样品加标回收实验:取两份相同的样品,其中一份加入定量的待测成分标准物质;两份同时按相同的分析步骤分析,加标的一份所得的结果减去未加标一份所得的结果,其差值同加入标准物质的理论值之比即为样品加标回收率[16].加标回收率计算公式:加标回收率= (加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%;现取实验样品1(低含量:浓度为0.1 mg/标准液),样品2(高含量:浓度为1.0 mg/标准液)平行制备为6份溶液,其中3份加入芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素和高良姜素标准对照品溶液;另外3份直接进行测定,并求其平均值.加标回收率计算公式:[(加标试样测定值-试样测定值)/加标值]×100%[17],营养元素见表6.

表6黄酮类化合物回收率测定结果(n=6)

黄酮类化合物名称试样值0.1/mg加标试样测定值/mg回收率/%试样RSD/%加标试样RSD/%试样值1.0/mg加标试样测定值/mg回收率/%试样RSD/%加标试样RSD/%芦丁0.09950.2005101.000.09960.2007101.100.09990.2008100.900.170.120.99972.0003100.060.99882.0012100.240.99991.999599.960.050.07

续表6

为进一步验证实验方法的可靠性,研究通过低含量加标和高含量加标进行测试并计算其回收率,黄酮类化合物计算结果见表3.样品1(低含量:浓度为0.1 mg/标准液):芦丁的回收率在100.9%～101.1%之间,RSD为0.12%,槲皮素的回收率在99.8%～100.1%之间,RSD为0.17%,杨梅素的回收率99.5%～100.1%之间,RSD为0.16%,芹菜素的回收率在98.9%～100.5%之间,RSD为0.56%,山萘酚的回收率在99.3%～100.5%之间,RSD为0.29%,乔松素的回收率在99.7%～100.9%之间,RSD为0.43%,高良姜素的回收率在99.7%～99.9%之间,RSD为0.12%;样品2(高含量:浓度为1.0mg/标准液):芦丁的回收率在100%～100.2%之间,RSD为0.07%,槲皮素的回收率在99.8%～100.1%之间,RSD为0.06%,杨梅素的回收率99.7%～100%之间,RSD为0.08%,芹菜素的回收率在99.9%～100%之间,RSD为0.07%,山萘酚回收率在100%～100.5%之间,RSD为0.04%,乔松素的回收率在100%～100.2%之间,RSD为0.11%,高良姜素的回收率在96.8%～100.1%之间,RSD为0.01%;加标回收率实验得出:该研究无论是低含量或是高含量7种黄酮类化合物的加标回收率在96.8%～100.2%之间,并且其RSD结果均小于1%,即蜂胶样品的基质效应对本方法影响较小,检测方法稳定可靠,发现回收率结果高浓度较低浓度好.

3 结论

研究采用微波消解和甲醇溶剂超声溶解法对蜂胶样品分别进行处理,甲醇溶剂超声溶解法更适合高效液相色谱法检测要求,样品处理充分彻底;各物质在0～6000 μg/L测定线性范围,呈现出良好线性关系,线性方程相关系数均在0.9997以上,加标回收率为96.8%～100.2%,运用高效液相色谱法(HPLC)测定了蜂胶中黄酮类化合物:发现海南五指山蜂胶中含有丰富的黄酮类化合物:如芦丁、槲皮素、杨梅素、芹菜素、山萘酚、乔松素、高良姜素等,测定结果发现芦丁的含量最高,其次是芹菜素,接着是杨梅素,其他四种黄酮类化合物均有检测到,黄酮类化合物的含量均在国家标准含量范围内[18];其总含量接近8.2%,超出国家标准含量8倍左右,属于二级蜂胶[19],实验结果满意.

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[19]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,中国国家标准化管理委员会.蜂胶:GB/T 24283-2009[S].北京:中国标准出版社,2009:12.

ContentDeterminationofFlavonoidsfromPropolisbyMethanolUltrasonicDissolution-HPLC

CHEN Wena, WANG Xiang-junb, LI Ling-yana, WANG Yu-jiea,HUANG Yu-zhia, QIAN Minga,ZHAO Xiu-zhia, MENG Fan-menga

(a.School of Ocean Science and Technology;b.School of Life Science and Ecology,Hainan Tropic Ocean University, Sanya Hainan 572022, China)

To optimize the experimental condition of determinating flavonoids compounds from propolis in Wuzhishan, the propolis samples were dealt with by methanol ultrasonic dissolution, in order to remove wax and fat-soluble impurities in propolis. 7 kinds of flavonoids compounds content were determinated by HPLC with Mobile phase—methanol-0.4% phosphoric acid (55/45, V/V)—at the detection wavelength of 270-360 nm.The operation of methanol ultrasonic dissolution is simple and quick.Compared with conventional analysis methods, HPLC has advantages such as simple and rapid determination, high recovery rate, low detection limit, high precision, low interference, and high accuracy.The result demonstrates that the content of flavonoids in propolis from Wuzhishan is within the range of the national standard, and the method is satisfactory.

Wuzhishan; propolis; methanol ultrasonic dissolution; HPLC; flavonoids

格式：陈文，王湘君,李凌燕，等.甲醇超声溶解-HPLC法测定蜂胶黄酮类化合物含量[J].海南热带海洋学院学报,2017,24(5):81-87.

2017-05-13

陈文(1980-),男,海南东方人,海南热带海洋学院海洋科学技术学院副教授,硕士,研究方向为天然产物化学成分分析、提纯、鉴定.

王湘君(1982-),女,重庆巴南人,生命科学与生态学院副教授,硕士,研究方向为生态学、动物学.

O656

A

2096-3122(2017) 05-0081-07

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.14

(编校李由明)