不同活性物质对大海马烂尾病病原菌的体外抑菌作用研究

姜芳燕,杨宁,冯慧敏,武耀廷,3

(1.海南热带海洋学院 海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室,海南 三亚 572022;2.三亚鑫海龙工贸有限公司,海南 三亚 572000; 3.海南大学, 海口 570228)

不同活性物质对大海马烂尾病病原菌的体外抑菌作用研究

姜芳燕1,杨宁2,冯慧敏1,武耀廷1,3

(1.海南热带海洋学院 海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室,海南 三亚 572022;2.三亚鑫海龙工贸有限公司,海南 三亚 572000; 3.海南大学, 海口 570228)

本研究考察不同活性物质对海马烂尾病病原菌PseudoalteromonasspongiaeHL11的抑菌作用,结果表明茶多酚、大蒜素、没食子酸、聚赖氨酸和乳酸5种活性物质具有抑菌效果,而其余13种活性物质没有抑菌效果.进一步对其进行单因素实验和正交实验,其最优复合抑菌配方为:茶多酚27.5 mg.L-1、没食子酸10 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1、聚赖氨酸100 mg.L-1,其最大抑菌圈直径为31.6 mm.本研究旨在为海马实际生产中烂尾病的防治,提供一种无毒副作用、无药物残留和健康环保的养殖方式.

大海马;海绵假交替单胞菌;抑菌实验;正交实验;活性物质

0 引言

海马(Hippocampusspp.)又名落龙子,隶属海龙科、海马属,是一种药用价值和观赏价值很高的小型海洋鱼类[1].海马品种庞杂,分类烦琐,现阶段全世界范围内共有54种,其中我国沿海区域约有13种[2].伴随着人类活动对海洋环境的破坏以及过度的捕捞活动,使得自然海域中野生海马的数量急剧减少[3].为了平衡野生海马资源保护和市场需求之间的矛盾,人工养殖海马是其主要解决方案之一[4].

随着海马养殖的工厂化程度加深,其病害问题也不可避免地凸显出来[5].海马病害的主要种类有真菌性疾病[6]、细菌性疾病[4]和寄生虫病[7],还有一些非细胞微生物比如病毒引起的疾病[8].鱼类细菌性烂尾病是一种发生于世界范围内的,严重危害众多品种养殖鱼类的疾病[9].严重时尾部烂掉,骨骼外露,传染率高,死亡快,可引起病鱼大批死亡.在海马实际养殖过程易患烂尾病,其主要症状表现为尾部皮肤发白、溃烂、肝脏糜烂、肠道发白或透明等,不及时隔离治疗会导致全部死亡.针对烂尾病的治疗,目前已报道患烂尾病的斜带石斑鱼[10]、剑尾鱼[9]、眼斑石首鱼[11]和大黄鱼[12]等常见养殖鱼类均采用庆大霉素、环丙沙星、复方新诺明以及左氟沙星等抗生素作为实际养殖生产用药.但是,抗生素的长期使用,不仅使病原菌产生耐药性,而且会影响海马自身的抗病能力,同时还存在着药物残留的问题[13].近年来,从天然植物特别是药用植物中寻找纯天然抗生物药物已成为研究热点[14].本课题组前期从患烂尾病的大海马分离鉴定其病原菌为海绵假交替单胞菌(PseudoalteromonasspongiaeHL11),并进行相关的药敏实验.本研究对大海马烂尾病原菌有抑菌作用的生物活性物质进行初步筛选,通过单因素实验和正交实验优化获得最佳复合抑菌配方,旨在为海马烂尾病的生物防治研究奠定基础.

1 材料与方法

1.1实验菌株

本实验中所用的大海马烂尾病原菌株为海绵假交替单胞菌(P.spongiaeHL11),由本课题组分离获得,于冰箱4℃保藏.

1.2试剂

茶多酚、壳聚糖、甲壳素、甜菜碱、曲酸和聚赖氨酸购自山东西亚化学股份有限公司,没食子酸购自天津市福晨化学试剂厂,大蒜素、蔓越莓提取物、紫雏菊提取物、马卡根粉、黑升麻提取物、接骨木提取物、南非醉茄和迷迭香叶提取物均购自美国健安喜(GNC)股份有限公司,其他化学试剂均为国产分析纯.

1.3培养基

酵母浸膏1 g,胰蛋白胨5 g,牛肉膏3 g,琼脂20 g,用沉淀、过滤海水定容至1 L,pH 7.2.种子培养基为液体培养基,不加琼脂.

1.4生物活性物质抑菌实验

生物活性物质抑菌活性的测定采用琼脂孔扩散对峙法.将菌悬液用生理盐水稀释至1.0×108cfu/mL,取100 μL均匀涂布于琼脂培养基上,然后在培养基上成“十”字形等距离打孔,每平板打4个孔,取 50 μL待测活性物质加入孔内,30℃恒温培养24 h后测量抑菌圈的直径.

1.5生物活性物质初筛

在查阅文献资料的基础上,考察茶多酚、Nisin、壳聚糖、甜菜碱和生姜提取物等18种天然活性物质成分对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果,进行有抑菌作用活性物质初筛.

1.6单因素优化

考察不同浓度活性物质对病原菌P.spongiae HL11抑菌效果.其中,茶多酚、乳酸和聚赖氨酸的浓度梯度均为100、50、25和12.5 mg.L-1.由于没食子酸的溶解度和大蒜素纯度的限制,将其溶度梯度设为40、20、10和5 mg.L-1.

1.7正交实验

在单因素抑菌实验的基础上,综合考虑没食子酸的溶解度和单因素抑菌效果,将其溶度固定在10 mg.L-1.以茶多酚、乳酸、大蒜素和聚赖氨酸等活性物质浓度为4个因素,以抑菌圈直径为响应值,采用L9(34)型正交试验,确定病原菌P.spongiaeHL11最佳复合抑菌配方.采用国际通用的统计软件MINITAB 15.0中的“DOE”模块中的“田口设计”进行试验方案的设计、试验结果的统计分析与优化、相关图表的生成等工作.具体的试验因素与水平设计见表1.

1.8数据分析处理

所有抑菌实验均为3个平行,选取抑菌圈比较明显的平板测定其抑菌圈直径,结果取3次重复实验的平均值.正交实验的方差分析采用MINITAB 15.0进行统计处理.

2 结果与讨论

2.1有抑菌作用的生物活性物质初筛

分别考察茶多酚、Nisin、壳聚糖、甜菜碱和生姜提取物等18种天然活性物质成分对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果.结果表明,茶多酚、乳酸、没食子酸、聚赖氨酸和大蒜素等5种活性物质有较好的抑菌效果,而其他13种活性物质并无抑菌效果.

表2 不同生物活性物质对病原菌P.spongiae HL11的抑菌效果

2.2单因素优化

进一步研究5种活性物质对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果,如图1所示.结果显示,茶多酚、没食子酸、乳酸、大蒜素和聚赖氨酸对菌株HL11的抑菌圈直径,都随着浓度的增加而增加.

图1 不同浓度的5种活性物质对病原菌P.spongiae HL11的抑菌效果

传统水产养殖业中,为了防治鱼病,经常在饲料中添加抗生素或激素,带来药物残留和抗药性等问题[15].天然食药用活性物质,具有毒副作用小、高效、健康无害、无残留等优点,避免由于使用抗生素带来的抗药性、养殖环境污染、药物残留超标等问题,同时满足人们对绿色水产品的需求,符合无公害水产养殖的发展趋势[16].茶多酚是茶叶中多酚类物质的总称,具有较强的抗氧化能力强,抑菌谱广,无毒副作用,可作为食品添加剂,被广泛应用于畜禽饲料中[15].龙萌等[15]研究表明茶多酚能显著提高了团头鲂幼鱼的增重率、特定生长率以及肌肉中粗蛋白含量,降低了饵料系数.没食子酸又称为五倍子酸、棓酸,是中药五倍子的主要有效成分之一,是现在许多常用于渔业生产中的单方或者复方中药的抑菌有效活性成分之一[16].现有大量研究结果表明,五倍子对鱼、虾、中华鳖、锯缘青蟹等水产动物的气单胞菌属、弧菌属等许多致病菌表现出很强的抑菌抗菌性能[16].乳酸广泛存在于如泡菜、腌肉、橄榄及酸奶等发酵食品中.乔支红等[17]研究报道乳酸对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、埃希氏大肠杆菌等3株食源性致病菌均有不同程度的抑制作用.大蒜素是大蒜瓣和蒜精油中含硫化合物的总称,是大蒜的主要生物活性成分,具有不同程度的抑菌作用,被誉为天然抑菌剂[18].大量研究表明,大蒜素能有效抑制气单胞菌、爱德华氏菌、鳗弧菌、鲁耶尔森氏菌等淡水鱼类的主要致病菌,对草鱼肠炎病、烂腮病、赤皮病和鲢鱼的出血病以及鱼类的暴发性传染病都特别有效[18].聚赖氨酸是由链霉菌属的少数菌种代谢产生的具有明显抑菌功能的L-赖氨酸聚合物,聚合度通常在25～35个赖氨酸[19].聚赖氨酸作为一种天然的微生物代谢产物,具有完全的可降解特性及生物相容性,在食品、营养保健、生物医学、材料、农业化学等领域均有广泛应用[20].上述5种活性物质,除没食子酸和大蒜素已应用于水产病害防治,其余的尚未有相关的应用报道.在本研究中,这5种活性物质对海马烂尾病病原菌P.spongiaeHL11的抑菌圈直径与课题组前期药敏实验中的大部分常用抗生素相当,且未表现出耐药性.而且茶多酚等5种活性物质,均为天然食药用成分,能通过海马代谢完全,无药物残留,无毒副作用,且不会产生抗药性,也不会对海马养殖水体环境造成污染.

2.3正交实验优化

采用正交实验设计从4个通过单因素抑菌实验筛选出的影响因子(即茶多酚、乳酸、聚赖氨酸和大蒜素)中筛选出具有显著影响因子.每个因子均采用高中低3个水平,正交实验设计及结果分析见表3,方差分析见表4.

以抑菌圈直径为响应值,对正交实验进行极差分析(表3).R值反应某个因素对实验结果的影响程度,极差越大则该因素对实验的结果影响越显著,反之影响会下降.由表3可知,不同活性物质对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌作用影响依次为D>C>A>B,即聚赖氨酸>大蒜素>茶多酚>乳酸.K值大小显示各因素水平对各活性物质抑菌活性的影响程度.各活性物质每个水平对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌作用依次为A2>A1>A3,B1>B2>B3,C3>C2>C1,D3>D2>D1.根据以上正交实验结果分析可知,其最优抑菌复合配方为：A2B1C3D3,即茶多酚27.5 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1和聚赖氨酸100 mg.L-1.

表3 正交实验结果及极差分析

针对以上结果,采用Minitab15.0软件进行方差分析,结果如表4所示,茶多酚、大蒜素和聚赖氨酸的P值小于0.05,均为显著因子,其中聚赖氨酸对抑菌圈直径影响最大,其次是茶多酚,最后是大蒜素.而乳酸的P值为0.598,属于不显著因子,其F值为0.53(<1),说明乳酸对抑菌圈直径的影响比误差项还小.因此四种活性物质浓度对病原菌P.spongiaeHL11的抑菌效果依次为聚赖氨酸>茶多酚>大蒜素>乳酸,与表3极差分析相一致.

表4 方差分析结果

图2 五种活性物质的主效应图

由各活性物质的主效应图(图2)可知,其最佳抑菌配方为茶多酚浓度(A2)为27.5 mg.L-1,乳酸浓度(B1)为10 mg.L-1,大蒜素浓度(C3)为30 mg.L-1,聚赖氨酸浓度(D3)为100 mg.L-1,与表3极差分析相吻合.为检验正交实验所得结果的可靠性,采用上述最优抑菌配方进行6次重复试验验证,结果显示抑菌圈直径大小平均值为31.6 mm,与理论预测值相吻合.因此,基于正交实验优化的天然活性物质对病原菌P.spongiaeHL11抑菌复合配方准确可靠,可用于实际养殖生产中.

3 结论

本研究以大海马烂尾病病原菌P.spongiaeHL11为研究对象,从茶多酚、Nisin、壳聚糖、甜菜碱和生姜提取物等18种天然活性物质成分筛选对其有抑菌作用的活性物质.体外抑菌实验结果表明,茶多酚、大蒜素、没食子酸、聚赖氨酸和乳酸等5种活性物质具有抑菌效果,而其余13种活性物质无抑菌作用.通过单因素实验,确定5种活性物质具有抑菌作用的浓度范围.进一步通过正交实验优化各活性物质的最优抑菌复合配方.根据抑菌实验的结果,确定复配活性物质的最佳组合为：茶多酚27.5 mg.L-1、没食子酸10 mg.L-1、乳酸10 mg.L-1、大蒜素30 mg.L-1和聚赖氨酸100 mg.L-1,其最大抑菌圈直径为31.6 mm.

以天然食药用活性物质代替传统抗生素在水产病害防治的应用,不仅能避免抗药性、药物残留、微生态平衡破坏、养殖环境污染等问题,而且可以提高其安全性,发展无公害水产养殖,具有重要的经济价值和社会价值.本研究旨在为海马实际生产中烂尾病的防治,提供一种无毒副作用、无药物残留和健康环保的养殖模式.课题组下一步将根据各种活性物质的抑菌机理、配伍方法、无公害养殖要求等,开发具有高效、无毒和使用方便等优点的活性物质复方配方,以拓展生物活性物质在水产养殖领域的应用范围.

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InvitroAntibacterialActivityofVariousActiveSubstancesagainstTail-rotDiseasePathogenofHippocampuskuda

JIANG Fang-yan1, YANG Ning2, FENG Hui-min1, WU Yao-ting1,3

(1.Key Laboratory of Tropic Sea Fishery Protection and Utilization of Hainan Province, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;2.Sanya Xin Hailong Industry and Trade Co.Ltd., Sanya Hainan 572000, China;3.Hannan University, Haikou 570228, China)

In the study, various active substances were tested for their antibacterial activity against tail-rot disease pathogenPseudoalteromonasspongiaeHL11 ofHippocampuskuda. The results indicated that 5 active substances—tea polyphenols, lactic acid, gallic acid, allicin and polylysine had antibacterial effect, while other 13 kinds of bioactive substances had no bacteriostatic effect.And then, the optimal antibacterial formulas gained by single factor experiment and orthogonal experiment are as follows:tea polyphenols 27.5 mg.L-1, gallic acid 10 mg.L-1, lactic acid 10 mg.L-1, allicin 30 mg.L-1， and polylysine 100 mg.L-1.Under optimal conditions, the maximum diameter of the inhibition zone was 31.6 mm.The aim of this study is to provide a non-toxic side effect, no drug residue, healthy and environmentally friendly culture mode for the control of tail-rot disease of seahorses in the actual production.

Hippocampuskuda;Pseudoalteromonasspongiae; antibacterial test; orthogonal experiment; bioactive substances

格式：姜芳燕,杨宁,冯慧敏,等.不同活性物质对大海马烂尾病病原菌的体外抑菌作用研究[J].海南热带海洋学院学报,2017,24(5):14-20.

2017-06-06

海南省重大科技项目(ZDKJ2016009);海南省应用技术研发与示范推广专项(ZDXM2015006);海南省科技兴海专项(XH201403);三亚市专项科研试制(2014CZ09);三亚市院地科技合作项目(2015YD07)

姜芳燕(1984-),女,浙江衢州人,海南热带海洋学院生命科学与生态学院副教授,博士,研究方向为水产养殖动物病害防治．

武耀廷(1962-),男,河南驻马店人,海南大学研究员,博士,研究方向为生物生态和农业科学.

S9

A

2096-3122(2017) 05-0014-07

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.03

(编校李由明)