不同脂肪源对点带石斑鱼四种免疫指标的影响

杨 宁, 黄 海,陈 友,马 军,陈 燕,廖经球, 巫火连

(1.三亚市南繁科学技术研究院,海南 三亚 572000;2.海南热带海洋学院 生命科学与生态学院,海南 三亚 572022;3.海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室,海南 三亚 572022;4.广东恒兴集团有限公司, 广东 湛江 524002;5.三亚市节能监察中心,海南 三亚572000 )

不同脂肪源对点带石斑鱼四种免疫指标的影响

杨 宁1, 黄 海2,3,陈 友2,3,马 军2,3,陈 燕2,3,廖经球4, 巫火连5

(1.三亚市南繁科学技术研究院,海南 三亚 572000;2.海南热带海洋学院 生命科学与生态学院,海南 三亚 572022;3.海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室,海南 三亚 572022;4.广东恒兴集团有限公司, 广东 湛江 524002;5.三亚市节能监察中心,海南 三亚572000 )

为研究不同脂肪源饲料对点带石斑鱼免疫力的影响,通过在饲料中添加玉米油、鱼油、花生油、大豆油、葵花籽油5种不同脂肪源,用于投喂点带石斑鱼并定期检测血液中的4种免疫指标.结果表明,不同脂肪酸源对石斑鱼血液中的红细胞数量有提高作用,其中玉米油组效果最为明显,在第7、28、35、42、49天时红细胞数量均显著提高(P<0.05).超氧化物歧化酶(SOD)实验中,除了第56天时试验组均低于对照组,其他周期有试验组的SOD含量高于对照组的,且差异显著(P<0.05);而在补体C3和溶菌酶实验中,各试验组的C3和溶菌酶含量呈周期性波动,不同脂肪源饲料对石斑鱼的补体C3和溶菌酶含量的影响存在差异.试验说明在饲料中添加脂肪酸对提高石斑鱼免疫力一定的影响,但不同脂肪源的影响效果存在差异.

点带石斑鱼;脂肪源;免疫

0 引言

点带石斑鱼(Epinepheluscoioides),俗称“青斑”,隶属辐鳍鱼纲,鲈形目,鮨科,石斑鱼属[1],属于暖水性岛礁鱼类,广泛分布于我国东南沿海.2013年,中国大陆石斑鱼产量是82434吨,占海水养殖鱼类产量的7.3%,其中点带石斑鱼是我国重要的石斑鱼养殖品种之一[2].但是,近年来我国石斑鱼养殖业为了追求高产和高经济效益,从传统的低密度养殖转为高密度、集约化、工厂化养殖的模式,使得养殖水质变差,点带石斑鱼生长性能退化,抗病力下降,病害较严重[3-5],限制了点带石斑鱼的养殖规模.

脂类作为三大能源物质之一,不仅为鱼类提供生长、繁殖所需的能量,还可以为鱼类提供必需脂肪酸,特别是不饱和脂肪酸有提高鱼类免疫力的作用[6].鱼类的必需脂肪酸主要包括n-3和n-6系列的不饱和脂肪酸,其中n-3系列不饱和脂肪酸包括二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和亚麻酸等,n-6系列不饱和脂肪酸包括亚油酸和花生四烯酸等.一般情况下,鱼油含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸较多,大豆油和葵花籽油含有亚油酸较多,花生油和玉米油含有亚油酸和花生四烯酸较多[7].本实验以鱼油、大豆油、花生油、葵花籽油、玉米油作为不饱和脂肪酸的脂肪源,添加到饲料中,探索不同脂肪源对点带石斑鱼免疫指标的影响,为今后石斑鱼配合饲料生产和石斑鱼免疫力研究提供理论依据.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1饲料和脂肪源

用于实验的颗料饲料主要由鱼粉、酵母、面粉、酪蛋白、多维等成分组成,干物质的化学组份为粗蛋白44%,粗脂肪15%,灰分11%,糖类20%,水份8%,其他物质2%.花生油和葵花籽油选自“金龙鱼”食用油,大豆油和玉米油选自“福临门”食用油,鱼油选自汤臣倍健股份有限公司.试验组是将鱼油、大豆油、花生油、玉米油和葵花油以5%比例分别与颗粒饲料混合,对照组是不混合外源肪脂酸的颗粒饲料.

1.1.2试验设备和试剂

试验设备主要有麦克奥迪实业集团有限公司的BA310-T型生物显微镜;北京六一仪器厂的WD-9403E紫外分光光度计;北京普朗新技术有限公司的DNM-9602G型酶标分析仪;玉环县求精医用仪器厂的XB-K-25型血细胞计数板.试剂主要有南京建成生物工程研究所生产的SOD、补体C3和溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)冻干粉试剂盒.

1.1.3试验鱼和养殖条件

点带石斑鱼来源于三亚简氏海水苗种繁育农民合作社,鱼体重46±2.8 g,选择体表无病征、摄食正常的健康点带石斑鱼用于试验.每个试验组和对照组设平行组一个,养殖水泥池面积约5平米,水深1.4 m,常流水状态,水温28-30℃,海水盐度30‰,溶氧大于5 mg/L.试验期间,上下午各投喂一次,投喂后换水体积占总水体积的二分之一.实验周期结束后,各试验组的饲料摄食量分别是：对照 36.85±0.34 g、玉米油 51.42±0.27 g、鱼油 51.59±0.99 g、花生油 41.44±2.00 g、大豆 36.94±0.89 g、油葵花籽油 37.29±2.27 g.

1.2方法

1.2.1血清的采集

在连续投喂60天后,从每个试验组和对照组养殖池中随机捞取点带石斑鱼用1 mL的无菌注射器进行尾动静脉法采取血液.将采到的血液置于4℃保存4 h,4℃条件下4000 r/min离心10 min制备血清,血清保存在-20℃冰箱中,用于测定血清超氧物化歧化酶(SOD)、血清补体C3含量和溶菌酶(LSZ)活性.

1.2.2抗凝血液的制备

用浓度为3000 U/mL的肝素钠溶液润洗一次性1 mL的灭菌注射器,然后对试验鱼进行尾动脉法采取血液,将血液注入含有肝素钠的1.5 mL离心管中,制成全血,放于4℃保存,用于红细胞计数.

1.2.3红细胞计数

用0.65%的生理盐水将抗凝血液进行稀释,稀释100倍,吸取稀释好倍数的血液滴到血细胞计数板上,计数方法参考相关文献[8].

1.2.4超氧化物歧化酶(SOD)的测定

采用南京建成生物工程研究所生产的超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒,

超氧化物歧化酶活力计算公式如下：

其中:反应体系稀释倍数为111倍,样本测试前的稀释倍数为1倍.

1.2.5血清中补体C3含量的测定

采用南京建成生物工程研究所生产的血清中补体C3测定试剂盒.

1.2.6血清中溶菌酶活性的测定

以溶壁微球菌(Micrococcuslysoleikticus)冻干粉为底物,将已经配好了放在冰箱保存备用的溶壁微球菌溶液取出.取3.0 mL的溶壁微球菌溶液与0.04 mL待测血清在试管中充分混匀,立刻用紫外分光光度计测其在540 nm处的吸光度值(A0),然后将装有待测溶液的试管放置于28℃的水浴锅里进行温育,温育30 min后取出立刻将其冰浴10 min以终止反应,再测其在540 nm处的吸光度值(A)[9].根据测量结果分析溶菌酶活力.

1.2.7数据处理

试验数据采用平均值±标准差表示,用SPSS 19进行数据分析,进行单因素方差分析(One-Way-ANOVA)和Duncan多重比较,P<0.05表示差异显著.

2 结果与分析

2.1不同脂肪源对点带石斑鱼红细胞数量的影响

由表1可见，第7天的红细胞数量,鱼油组、花生油组、葵花油组均高于对照组,且与对照组差异显著(P<0.05),大豆油组虽然比对照组高,但差异不显著(P>0.05);第14天的红细胞数量,试验组均低于对照组,其中玉米油组和对照组差异不显著(P>0.05);第21天的红细胞数量,鱼油组和玉米油组虽然比对照组高,但差异不显著(P>0.05);第28天的红细胞数量,玉米油组、鱼油组、大豆油组高于对照组,差异显著(P<0.05);第35天的红细胞数量,玉米油组、鱼油组、花生油组和葵花籽油组高于对照组,差异显著(P<0.05);第42天的红细胞数量,玉米油组高于对照组,且差异显著(P<0.05);第49天的红细胞数量,各试验组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第56天的红细胞数量,各试验组和对照组相比,差异不显著(P>0.05).

表1 不同脂肪源对点带石斑鱼红细胞数量的影响(109个/μL) n=3; (X±SD)

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.2不同脂肪源对点带石斑鱼超氧化物歧化酶(SOD)的影响

由表2可见，第7天的SOD,试验组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第14天,鱼油组、花生油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第21天,鱼油组、花生油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第28天,鱼油组、花生油组、大豆油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第35天,鱼油组、花生油组、大豆油组、葵花油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第42天,葵花油组高于对照组,且差异显著(P<0.05);第49天,玉米油组、大豆油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第56天,试验组均低于对照组(P<0.05).

表2 不同脂肪源对点带石斑鱼超氧化物歧化酶(SOD)的影响 ( U/mL ) n=3; (X±SD)

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.3不同脂肪源对点带石斑鱼补体C3的影响

由表3可见，第7天的补体C3,玉米油组高于对照组,且差异显著(P<0.05);第14天,鱼油组、花生油组、大豆油组和葵花油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第21天,各试验组均低于对照组,且差异显著(P<0.05);第28天,各试验组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第35天,玉米油组和大豆油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第42天,玉米油组和大豆油组均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);第49天,试验组均低于对照组,且差异显著(P<0.05);第56天,试验组均低于对照组,其中大豆油组和葵花油组差异显著(P<0.05).

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

2.4不同脂肪源对点带石斑鱼溶菌酶活性的影响

由表4可见，第7天的溶菌酶,试验组均低于对照组且差异显著(P<0.05);第14天,花生油组高于对照组,且差异显著(P<0.05);第21天,各试验组均低于对照组,且差异显著(P<0.05);第28天,大豆油组高于对照组,且差异显著(P<0.05);第35天,鱼油组和大豆油组均高于对照组,且差异显著(P<0.05);第42天,大豆油组高于对照组,但差异不显著(P>0.05);第49天,除了葵花籽油,其他试验组均高于对照组,但差异不显著(P>0.05);第56天,鱼油组低于对照组,且差异显著(P<0.05);其他试验组虽然低于对照组,但差异不显著(P>0.05).

注：同一列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)

3 讨论

水产动物的免疫系统主要由特异性免疫和非特异性免疫系统组成,鱼类由于仅有IgM,免疫球蛋白的种类和功能并不完整,使其特异性免疫系统处于低级水平.而甲壳动物和软体动物等水产养殖品种,体内缺乏免疫球蛋白,其免疫系统主要由非特异性免疫系统构成.在集约化水产养殖中,饲料营养和水产动物病害防治的关系越来越受到重视,研究表明,饲料的营养水平影响水产动物的健康状况,水产动物的健康状况反过来也影响饵料的营养需要量[10].

3.1不同脂肪源对点带石斑鱼红细胞数量的影响

红细胞具有运送氧气、二氧化碳、调节pH等功能,此外,还是鱼类主要的免疫细胞之一,研究表明鱼类的红细胞具有一定的黏附、吞噬等类似白细胞的免疫功能[11-12].

目前,有关不同脂肪源对红细胞的影响主要集中在对红细胞数量的研究.唐威[13]研究不同脂肪源对斑点叉尾鮰(IetalurusPunetaus)红细胞数量的影响,结果表明鱼油组血液红细胞总数最大,且显著大于豆油、鱼油、牛油混合油组.肖温温[14]通过投喂大口黑鲈 (Micropterussalmoides) 8种不同脂肪源与蛋白质含量比的饲料,发现不同配比的饲料对大口黑鲈红细胞数量有显著影响.随着饲料中脂肪与蛋白含量比的升高,红细胞数量呈现先升高后降低的趋势.本研究发现,不同脂肪源对点带石斑鱼红细胞数量有显著影响.其中,第49天时,各试验组均高于对照组,且差异显著(P<0.05).不同脂肪酸源中,以鱼油、玉米油效果较好,花生油、大豆油和葵花油次之(见表1).

3.2不同脂肪源对点带石斑鱼超氧化物歧化酶(SOD)的影响

超氧化物歧化酶(SOD)有提高鱼体细胞防御能力和提高机体免疫的功能,SOD活性大小与鱼类的免疫力密切相关.肖温温[14]研究发现饲料中不同脂肪源对SOD的影响显著(P<0.05),且随着饲料中不同脂肪源与蛋白质含量比的增加呈现先升高后降低的趋势.但唐威[13]研究不同脂肪源对斑点叉尾鮰SOD的影响,结果表明豆油、鱼油、牛油及其混合油对斑点叉尾鮰血清SOD无显著性影响 (P>0.05).杨鸢劼等[9]用含不同比例不饱和脂肪酸饲料投喂黄鳝(Monopterusalbus),各试验组与对照组相比血清 SOD 在 116.95～333.44 U/m L 之间,但无显著差异 (P>0.05).本实验研究结果表明,除了第56天时,不同脂肪源都能提高点带石斑鱼的超氧化物歧化酶(SOD)含量,其中,大豆油组在第49天时,SOD可达至170.62 U/mL(见表2).不同研究者研究的差异,可能与试验动物、脂肪酸的来源不同有关.

3.3不同脂肪源对点带石斑鱼补体C3的影响

鱼类补体C3的激活产物具有吞噬和溶解病原体、调节和增强体液免疫的重要作用,是鱼类免疫力的重要衡量指标之一.本实验研究发现,第7、14、28、35天的补体C3,试验组均不同程度的高于对照组,且差异显著(P<0.05),其中最高值出现在第28天的葵花籽油组,达106.90 U/mL,但在第21、42、49、56天,试验组低于对照组或者高于对照组但不显著(见表3).不同脂肪源对补体C3的提高作用与部分学者研究结果一致,肖温温[14]研究发现饲料中脂肪与蛋白质水平对补体活性的影响显著(P<0.05),随着饲料中不同脂肪源与蛋白质含量比的增加呈现先升高后降低的趋势.这说明了在饲料中添加一定量的脂肪酸对提供鱼类补体C3有显著影响作用.

3.4不同脂肪源对点带石斑鱼溶菌酶的影响

血清中的溶菌酶是抵抗外来物入侵时非特异性免疫调节因子,其含量的高低可以反映鱼体非特异性免疫水平的高低.周小秋等[15]通过调整不饱和脂肪酸n-3和n-6的比例,在总含量保持不变的条件下,发现对建鲤(CyprinuscarpiovarJian)溶菌酶提高效果显著.Lin等[16]研究发现,马拉巴石斑鱼(Arggropsbleekeri)稚鱼血清溶菌酶活力随着饲料中的多不饱和脂肪酸水平的增加而显著提高.陈威志[17]研究多不饱和脂肪酸对军曹鱼幼鱼免疫力的影响发现,不同比例的植物油、鱼油投喂试验鱼,全植物油组的血清溶菌酶活性较低.唐威[13]研究豆油、鱼油、牛油及其混合油对斑点叉尾鮰血清中溶菌酶活性的影响,结果表明豆油组活性最高,但与牛油组、鱼油组相比无显著性差异,但显著高于各比例的混合油组.肖温温[14]研究发现饲料中添加不同脂肪源对大口黑鲈血清溶菌酶活力影响显著.杨鸢劼等[9]用含不同比例不饱和脂肪酸饲料投喂黄鳝,各试验组的溶菌酶与对照组相比有不同程度的提高,其中,最高值可达94.90 U/mL.本实验结果表明,不同脂肪源对点带石斑鱼的溶菌酶含量有一定的影响,花生油组在第14天时,大豆油组在第28天时,鱼油组和大豆油在第35天时,均高于对照组.在其他测试时间时实验组的溶菌酶含量与对照组的差异不显著或低于实验组(见表4),这可能与鱼类血清中的溶菌酶的周期性变化有关.

综上所述,在饲料中添加不同脂肪源对点带石斑鱼的四种免疫指标都有不同程度的提高作用,说明添加脂肪酸对于提高石斑鱼免疫力有较好的作用.有学者研究发现鱼类对脂肪的需求是有一定适合范围的,脂肪过多不仅起不到提高免疫力的作用,还会引起脂肪肝等疾病、造成饲料成本升高[18].因此,有必要进一步开展不同脂肪酸源的添加比例以及混合脂肪源饲料对点带石斑鱼免疫力影响的研究.

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EffectsofDifferentFatSourcesonFourImmuneIndicesofEpinepheluscoioides

YANG Ning1,HUAN Hai2,3,CHEN You2,3,MA Jun2,3,CHENG Yan2,3, LIAO Jing-qiu4, WU Huo-lian5

(1.Sanya Science & Technology Academy of Breeding and Multiplication,Sanya Hainan 572000,China;2.School of Life Science and Ecology,Hainan Tropical Ocean University,Sanya Hainan 527022,China; 3.Key Laboratory of Tropic Sea Fishery Protection and Utilization of Hainan Province,Sanya Hainan 527022,China;4.Guangdong Hengxing Co.Ltd.,Zhanjiang Guangdong 524002,China;5.Sanya Energy Conservation & Supervision Center,Sanya Hainan 572000,China)

The effect of 5 kinds of fat feeding sources—corn oil,fish oil, peanut oil, soybean oil, sunflower oil—on the immune capability ofEpinepheluscoioidesis studied, in order to screen the fat source which is beneficial to improve the group resistance.The results showed that the fat sources, among which corn oil has outstanding improvement on the 7th, 28th, 35th, 42nd, 49th day (P<0.05), raise the number of red blood cells of the test group.In the experiment of superoxide dismutase (SOD), in all cycles except for on the 56th day, the content of SOD of the experimental groups is remarkably higher than that of the controlled groups(P<0.05). In the experiment of the complement C3 and lysozyme, the result demonstrated the cyclical movement of the content of the complement C3 and lysozyme in the experimental groups during various test periods.However, different fat feeding source has different effect on the content of the complement C3 and lysozyme in the experimental groups.The results showed that adding fat source in feeding has certain effect of improving the immune capability ofEpinepheluscoioides, but different fat feeding resource has different effect.

Epinepheluscoioides; fat source; immunity

格式：杨宁,黄海,陈友,等.不同脂肪源对点带石斑鱼四种免疫指标的影响[J].海南热带海洋学院,2017,24(5):8-13.

2017-05-15

海南省自然科学基金项目(313110)，三亚市院地科技合作项目( 2015YD08)

杨宁(1980-),男, 河北秦皇岛人,三亚市南繁科学技术研究院高级工程师,硕士,研究方向为水产养殖动物病害防治.

黄海(1974-),男,海南三亚人,海南省热带海洋渔业资源保护与利用重点实验室研究员,博士,研究方向为水产养殖.

S965.334

A

2096-3122(2017) 05-0008-06

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.05.02

(编校李由明)