立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因克隆与分子进化分析

舒灿伟，曹琦琦，赵 美，江绍锋，周而勋

(1.华南农业大学 农学院，植物病理学系，广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642；2.贵州省出入境检验检疫局，贵州 贵阳 550081)

立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因克隆与分子进化分析

舒灿伟1，曹琦琦2，赵 美1，江绍锋1，周而勋1

(1.华南农业大学 农学院，植物病理学系，广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室，广东 广州 510642；2.贵州省出入境检验检疫局，贵州 贵阳 550081)

为了揭示立枯丝核菌不同融合群菌株G蛋白β亚基基因的差异，利用同源克隆的方法，克隆了立枯丝核菌8个融合群共13个菌株的G蛋白β亚基基因，并进行分子进化分析。序列分析结果发现，不同融合群的立枯丝核菌的G蛋白β亚基基因的内含子和开放阅读框数目一致，编码氨基酸均为347个。但氨基酸序列存在14个位点的突变。同源性分析表明，立枯丝核菌各个融合群G蛋白β亚基基因之间的同源性较高，同一亚群的菌株同源性达到100%，不同融合群之间存在差异。分子进化分析表明，不同物种的G蛋白β亚基基因在进化上仍具有一定的保守性，不同融合群菌株的G蛋白β亚基基因序列聚为一个分枝且与同属担子菌门的物种同源性最高。该研究揭示了立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的特征，为该菌基因功能和分子检测研究奠定了基础。

立枯丝核菌；融合群；G蛋白；基因克隆；分子进化

丝核菌(Rhizoctoniasolani)在自然界中广泛存在于土壤及各种不同类型的寄主植物上，引起多种植物的严重病害[1]。但它们在致病性、形态学、培养性状及生理特征等诸多方面均有所不同。目前国际上普遍采用Ogoshi的融合群标准菌株对立枯丝核菌进行分类[2]。到目前为止，立枯丝核菌的融合群已有14个；同一个融合群内的菌株由于相互之间融合频率不同，或具有独特特性(如特异的寄主范围、营养要求或分子标记在遗传上的不同)而划分为融合亚群[3-4]。

近年来，随着分子生物学及相关技术方法的迅速发展，结合菌丝融合群与分子生物学手段对丝核菌进行研究已是主要方向[5]。G蛋白β亚基编码的蛋白作为重要的信号传导蛋白，对致病机理起着非常重要的作用[6]。目前，全世界已利用同源克隆的方法成功地对30多个物种G蛋白β亚基基因进行了克隆，其中哺乳动物G蛋白β亚基基因4个，植物G蛋白β亚基基因5个，真菌G蛋白β亚基基因20个，其他类型G蛋白β亚基基因7个，并研究了这些基因的功能[7]。在真核生物中，G蛋白β亚基基因参与信号传导途径，导致基因表达、细胞功能受到影响[5-8]。在植物病原真菌中，G蛋白β亚基参与了病原菌的致病过程[9-12]。Kasahara等[13]对板栗疫病菌(Cryphonectriaparasitica)的研究发现，丧失β亚基基因功能导致菌丝缺乏明显分叉，对寄主植物的侵染和致病力明显降低，并影响孢子的形成。但目前对水稻纹枯病菌(R.solaniAG-1 IA)G蛋白β亚基基因功能分析的有关报道还比较少。

本研究利用同源克隆的方法，克隆立枯丝核菌8个融合群及其亚群菌株的G蛋白β亚基基因，分析不同融合群之间以及与其他物种的G蛋白β亚基基因之间在分子进化上的关系，为G蛋白β亚基基因在立枯丝核菌不同融合群中的功能分析和分子检测奠定基础。

1 材料和方法

1.1供试菌株

供试菌株为立枯丝核菌8个融合群11个融合亚群的11个国际标准融合群菌株(AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-4、AG-5、AG-6、AG-8、AG-9和AG-BI)以及国内分离鉴定的属于AG-1 IA的强致病力菌株GD-118和C-30，共13个菌株。其中AG-1 IA(GD-118)和AG-1 IA(C-30)菌株由广东省微生物信号与作物病害防控重点实验室保存，其余菌株由日本北海道大学Ogoshi教授惠赠。

1.2主要试剂和仪器

真菌核酸提取试剂盒(货号9765、9108)、高保真酶、克隆载体pMD20-T、大肠杆菌JM109、反转录试剂盒等均购自TaKaRa公司；引物合成和测序由奥科生物公司完成。PCR扩增仪veriti 96-well Thermal cycle 9902购自美国Torrey Pines Scientific公司；凝胶成像系统Alpha Imager EP购自美国Alpha Innotech 公司。

1.3菌株纯化及菌丝收集

将保存于斜面上的菌种移到水琼脂平板活化后，在PDA上生长2 d。用内径5 mm的打孔器在菌落边沿打取菌饼，将5块菌饼接入到100 mL PDB培养基中，在28 ℃下振荡培养3～4 d。菌丝体用无菌滤纸过滤后，用ddH2O洗涤2～3次，吸干水分后马上用液氮冷冻，放入-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4核酸提取和PCR扩增

核酸提取的具体步骤详见产品说明书。以DNA为模板，用高保真酶进行PCR扩增，所用引物序列为：F：5′-TGGCTTGTTGGGTTGA-3′；R：5′-TGACCACGACCAAATGAA-3′。扩增程序为：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，退火温度下复性40 s，72 ℃延伸1 min(35个循环)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。同样以RNA为模板，用一步法反转录试剂盒进行RT-PCR扩增，所用引物序列为：F：5′-ATG

TCGAACCAAGGAGATATT-3′；R：5′-TTACGCCCAGA

CCTTGAG-3′。扩增程序为：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，退火温度下30 s，72 ℃ 1 min(30个循环)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。分别将PCR与RT-PCR的产物切胶回收，连接到克隆载体pMD20-T，再转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109感受态细胞。通过蓝白斑筛选和PCR验证，将阳性克隆子送往奥科公司测序。

1.5序列分析

1.5.1 分子进化分析 利用DNAStar软件分析13个菌株G蛋白β亚基基因DNA序列的相似度，并利用MEGA 7软件和iIOL网站(http：//itol.embl.de/)构建13个菌株以及与其他植物病原真菌G蛋白β亚基基因的分子进化树。

1.5.2 开放阅读框和内含子分析 用DNAMAN软件将13个菌株的gDNA序列和cDNA序列进行比对，分析内含子的位置并进行氨基酸比对。用DNAStar软件查找13个菌株G蛋白β亚基基因cDNA全长序列的开放阅读框(Open reading frame，ORF)。

2 结果与分析

2.1核酸的提取结果

立枯丝核菌13个菌株的DNA(图1-A)和RNA(图1-B)电泳结果表明，所提取的核酸条带完整，没有降解现象，电泳背景干净，没有杂质残留。通过微量紫外分光光度检测，所有样品的浓度和纯度都能满足后续的研究。

A.DNA；B.RNA。M.DL10000、DL2000；1.AG-1 IA；2.AG-1 IB；3.AG-1 IC；4.AG-2-1；5.AG-2-2ⅢB；6.AG-4；7.AG-5；8.AG-6；9.AG-8；10.AG-9；11.AG-BI；12.AG-1 IA(GD-118)；13.AG-1 IA(C-30)。图2，4同。M.DL10000，DL2000；1.AG-1 IA；2.AG-1 IB；3.AG-1 IC；4.AG-2-1；5.AG-2-2ⅢB；6.AG-4；7.AG-5；8.AG-6；9.AG-8；10.AG-9；11.AG-BI；12.AG-1 IA(GD-118)；13.AG-1 IA(C-30).The same as Fig.2,4。

2.2PCR扩增结果

PCR的扩增产物电泳结果表明，AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IC、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-4、AG-6、AG-8、AG-9、AG-BI融合群标准菌株和GD-118、C-30这12个菌株扩增条带大约为1 800 bp，而融合群AG-5标准菌株扩增条带大约为1 500 bp(图2-A)；RT-PCR的扩增产物电泳结果表明，13个菌株均扩增出大约1 000 bp的目的条带(图2-B)。

A.PCR；B. RT-PCR;M.DL2000。

2.3序列比对结果分析

将PCR和RT-PCR扩增产物进行克隆测序，序列分析结果表明，13个菌株G蛋白β亚基基因序列的总体相似性为88.93%，具有较高的同源性；其中AG-1 IA亚群的标准菌株与从我国分离到的同一个融合亚群的菌株AG-1 IA(GD-118)和AG-1 IA(C-30)(均分离自水稻)的相似度达到100%。融合群/亚群AG-1 IA、AG-1 IB、 AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-6、AG-8和AG-9的序列相似性达到99.55%，也表现出了很高的同源性。融合群AG-6、AG-8、AG-9的G蛋白β亚基基因序列的相似性达到99.74%，也具有很高的同源性。融合群AG-4和AG-5、AG-4和AG-6、AG-5和AG-6的相似性分别为69.48%，70.63%和64.85%，同源性较低。桥梁菌株AG-BI与AG-1 IA、AG-4、AG-5、AG-6和AG-1 IC的序列相似性分别81.75%，70.15%，64.44%，81.34%和79.58%。

2.4分子进化分析

本研究采用MEGA 7软件和iTOL网站分析了立枯丝核菌不同融合群菌株的G蛋白β亚基基因与其他真菌G蛋白β亚基基因的亲缘关系。结果表明(图3)，立枯丝核菌的13个菌株与同属于担子菌门(Basidiomycota)的玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)聚在一个大的分枝，其分子进化关系较其他真菌门的菌较近，并且同属一门不同属之间真菌之间表现出较近的亲缘关系，因而可知不同物种之间G蛋白β亚基基因在进化上具有保守性。从图3还可看出，AG-BI、AG-1 IC、AG-4、AG-5这4个融合群/亚群菌株的亲缘关系较远。AG-6、AG-8、AG-9这3个融合群可聚在一个分支，AG-1 IA、AG-1 IB、AG-2-1、AG-2-2ⅢB、AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)可分布成一支，因此它们的分子进化关系较近。

玉米黑粉菌.基因库编号：AF536325.1；粗糙脉孢菌.基因库编号：AF491286.1；大丽轮枝菌.基因库编号：JQ665433.1；尖孢镰刀菌.基因库编号：AY219172.2；裂殖酵母.基因库编号：L28061；异旋孢腔菌.基因库编号：AY211190.2。Ustilago maydis.GenBank：AF536325.1； Neurospora crassa .GenBank：AF491286.1；Verticillium dahliae.GenBank：JQ665433.1；Fusarium oxysporum.GenBank：AY219172.2；Schizosaccharomyces pombe.GenBank：L28061；Cochliobolus heterostrophus.GenBank：AY211190.2.

2.5G蛋白β亚基基因全长序列和内含子分析

用DNAStar软件查找开放阅读框(ORF)，得到一个完整的ORF，说明此序列是一个G蛋白β亚基基因的全长序列。 用DNAMAN软件分析13个菌株G蛋白β亚基基因的gDNA序列和cDNA序列，发现G蛋白β亚基基因均存在4个内含子。

2.6氨基酸序列分析比对

把8个融合群13个菌株的G蛋白β亚基基因的cDNA全长序列翻译成氨基酸序列再用DNAMAN软件进行比对，发现该基因编码347个氨基酸，比对结果表明，存在14个氨基酸的差异，其中第27，37，83，182，222，225，233，264，270，272，320，329位氨基酸存在1个位点的差异，而第31和35位存在2个氨基酸位点差异(图4)。同属一个融合亚群的序列没有发生突变，序列保守性比较强；而发生氨基酸位点差异主要是AG-4、AG-5和AG-BI这3个融合亚群。

3 结论与讨论

G蛋白是细胞内一类重要的信号传导蛋白，在高等动物、简单真核生物、昆虫及植物中普遍存在[14]。目前的研究表明，G蛋白的转膜信号的中介作用，并且对该系统各组分的不断研究已成为生物化学和分子生物学领域的研究热点[6，13，15]。G蛋白β亚基编码的蛋白作为重要的信号传导蛋白，在致病机理方面起着非常重要的作用[13，16-18]。

关于植物病原真菌G蛋白β亚基基因的克隆与功能已有较多报道，这些研究发现，真菌G蛋白β亚基主要是在病菌交配过程中起作用，也发现 G蛋白β亚基功能缺失后的菌株毒性丧失[19]。Nishimura等[20]研究发现，稻瘟菌(Magnaporthegrisea) G蛋白β亚基基因MGB1 缺失突变体会表现出产孢量下降，致病力减弱。在尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和玉米赤霉(Gibberellazeae)中，G蛋白β亚基基因可影响真菌毒素产生和致病力[21]。Delgado-Jarana 等[22]发现，尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)的 G蛋白β亚基通过参与 cAMP或独立于 cAMP 的代谢途径控制病菌的生长、发育和致病过程。

图4 立枯丝核菌G蛋白β亚基氨基酸序列比对Fig.4 Alignment of the amino acid sequences of G protein β subunit of Rhizoctonia solani

本研究比较了立枯丝核菌8个融合群13个菌株的G蛋白β亚基基因序列，发现它们之间相似度较高，但有些融合群的G蛋白β亚基基因之间存在一些差异。不同融合群菌株的G蛋白β亚基基因的同源性的高低与是否为同一融合群并没有太大的联系。融合群是根据菌丝融合测定的方法来划分的，是在生物学水平上的分类，并不能代表其在分子水平的差异。但同一亚群菌株的G蛋白β亚基基因同源性达到100%，说明同一融合亚群菌株之间的G蛋白β亚基基因没有出现遗传分化[2-3]。为进一步直观揭示这些差异，本研究构建了立枯丝核菌G蛋白β亚基基因序列的分子进化树，发现了AG-1 IA、AG-1 IB、AG-1 IA(GD-118)、AG-1 IA(C-30)、AG-2-1、AG-2-2ⅢB为一支，进化关系比较近。AG-6、AG-8和AG-9为一支，其进化关系最近。而AG-1 IC、AG-4、AG-5和AG-BI聚为一支，亲缘关系较远。比较立枯丝核菌不同融合群菌株与其他近缘真菌G蛋白β亚基基因的相似性及亲缘关系的远近，结果发现立枯丝核菌和玉米黑粉菌同属于担子菌门，表现出的亲缘关系较其他真菌门的真菌较近，并且同门真菌的属之间也表现出较近的亲缘关系，因而可知不同物种之间G蛋白β亚基基因在进化上具有保守性，这可能提示其功能的保守性。本研究找出了立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的4个内含子，对立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的相关功能表达研究具有指导意义。同时，本研究比较了立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因翻译蛋白(氨基酸)全长序列的差异，对研究立枯丝核菌不同融合群G蛋白β亚基基因的分化和分子检测具有重要意义。

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CloningandSequenceAnalysisofG-proteinBeta-subunitGenesinDifferentAnastomosisGroupsofRhizoctoniasolani

SHU Canwei1，CAO Qiqi2，ZHAO Mei1，JIANG Shaofeng1，ZHOU Erxun1

(1.College of Agriculture，South China Agricultural University，Department of Plant Pathology，Guangdong Province Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control，Guangzhou 510642，China；2.Guizhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of the People′s Republic of China，Guiyang 550081，China)

To study the genetic difference and molecular evolution of G protein beta-subunit gene ofRhizoctoniasolani. Full length of gDNA and cDNA sequences of G protein beta-subunit gene of 13 strains from 8 anastomosis groups (AGs) ofRhizoctoniasolaniwere cloned and analyzed by homology-based cloning method. It showed that the number of intron and open reading frames were consistent in different isolates，which encoded 347 amino acids with 14 point mutations. Homology analysis showed that the homology between AGs ofR.solaniwas high，and the similarity percent of isolates from the same intraspecific group was 100%. But there were genetic diverse among different AGs in homology. The phylogenetic analysis indicated that the G protein beta-subunit gene could effectively distinguish different AGs，and it also could differentiate all the AGs ofR.solanifrom other fungi. It revealed the characteristic of G protein beta-subunit gene in different AGs fromR.solani，and laid the foundation for the gene functional analysis and molecular detection of this fungus.

Rhizoctoniasolani；Anastomosis groups；G protein；Gene cloning；Molecular evolution

2017-06-21

广东省自然科学基金(博士启动)项目(2016A030310454)；国家自然科学基金项目(31470247)；国家公益性行业(农业)科研专项经费项目(No. 201403075)

舒灿伟(1985-)，男，广东潮安人，讲师，博士，主要从事植物病原真菌及真菌病害研究。舒灿伟、曹琦琦为同等贡献作者。

周而勋(1963-)，男，广东高州人，教授，博士，主要从事植物病原真菌及真菌病害研究。

Q78

A

1000-7091(2017)05-0007-06

10.7668/hbnxb.2017.05.002