硒化糯米蛋白抗氧化活性的研究

隋春红，李校娜，徐亚维，纪朋艳，王程※

（1吉林医药学院药学院，吉林132013；2吉林农业科技学院生物工程学院，吉林132101）

硒化糯米蛋白抗氧化活性的研究

隋春红1，李校娜1，徐亚维2，纪朋艳1，王程1※

（1吉林医药学院药学院，吉林132013；2吉林农业科技学院生物工程学院，吉林132101）

采用化学修饰法将碱提酸沉法分离获得的糯米蛋白制备成硒化糯米蛋白（Se-GP）并鉴定其抗氧化活性。研究表明制备的多种Se-GP均具有一定的谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力，其中Se-GP14的GPX活力最高，约为51.49 U/g。各种Se-GP均可发挥清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）、羟自由基（OH·）和超氧阴离子（）自由基的作用，并可有效维持抗坏血酸/二价铁离子（Vc/Fe2+）诱导损伤的牛心肌线粒体的形态和正常功能，抑制损伤线粒体的膨胀，降低线粒体中脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的产生。

糯米蛋白；硒；抗氧化活性

硒（selenium，Se）是一种必需微量元素，人体缺少Se元素可能会出现大骨节病、克山病、甲状腺疾病等[1]，研究发现Se在预防和治疗癌症、心血管系统疾病、肝病、高血压、糖尿病等多种疾病过程中发挥着重要的作用[2]。人主要从植物硒蛋白中摄取Se，其形式主要以硒代蛋氨酸（selenomethionine，Se-Met）和硒代半胱氨酸（selenocysteine，Se-Cys）存在[3-4]。目前，富硒作物已经在我国大力开发种植，但由于我国大部分地区土壤中Se含量并不丰富，仅靠富硒作物的生产很难满足人们的补Se需求，因此，大量人工制备植物源硒蛋白成为研究的焦点。糯米是稻米的一种，也是人类主要粮食之一。糯米蛋白（glutinous protein，GP）的氨基酸平衡特性好，营养价值高，主要是由球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶性蛋白四种蛋白组成，是很好的植物蛋白资源[5]。本研究尝试以糯米为原料，采用碱提酸沉法提取GP并利用凝胶层析法分离各组分，再采用化学硒化法制备Se-GP并检测其抗氧化活性，以弥补栽培高硒糯米的不足，为合理开发植物蛋白质资源提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

东北有机糯米（蛋白含量10.2%）购自吉林市永鹏农副产品开发有限公司。新鲜牛心于市场购买。透析袋3500购自美国Spectium公司；考马斯亮蓝R-250、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、四甲基二乙胺（TEMED）购自上海碧云天生物技术有限公司；Sephadex G-25购自瑞典Pharmacia公司；牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma公司。苯甲基磺酰氟（PMSF）、半胱氨酸、硒粉、还原型谷胱甘肽（GSH）、巯基乙醇、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）、甘氨酸、邻苯三酚、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）、GSH还原酶购自美国Sigma公司；硒标准液（国家标准物质研究中心）；硫代巴比妥酸（TBA）、邻苯三酚、二硫二硝基苯甲酸（DTNB）、抗坏血酸（VC）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、巯基乙醇、二苯基三硝基苯肼自由基（DPPH·）、依布硒（Ebselen）、三氯乙酸（TCA）购自美国Sigma公司；Na2HPO4、水杨酸、NaH2PO4、NaBH4、FeSO4、H2O2购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白分子量Marker购自美国Transgen公司。

AFS-230E型双道原子荧光光度计（北京海光仪器公司）；FD-1C-50型冷冻干燥机（上海比朗仪器有限公司）；LDI-1700基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（美国Linear Scientific公司）；HD-4核酸蛋白检测仪（上海沪西分析仪器厂）；UV-2550紫外分光光度计、AA-6300型原子吸收分光光度计、Se空心阴极灯（日本岛津公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 碱提酸沉法提取糯米蛋白将糯米在60℃下烘干至恒重，研磨成粉后过80目筛。以料液比1 g/10 mL往糯米粉中加入蒸馏水，并加1 mol/L NaOH碱液调节pH=10，在45℃恒温水浴中碱解6 h。将混合物在4000 r/min条件下，离心10 min，然后取上清液置于烧杯中，滴加1 mol/L稀盐酸调节pH=4.0（蛋白质等电点），在4℃冰箱中静置24 h使蛋白质沉淀，洗涤沉淀并冷冻干燥后获得GP。用Lowry法[6]测定GP粗蛋白质含量计算提取率，蛋白质的提取率（%）=提取GP的质量（g）/糯米原料中蛋白质的质量（g）×100%。

1.2.2 GP组分的分离与分子量测定使用Suphedex G-25凝胶层析分离GP各组分，凝胶柱100 cm×2.6 cm，用pH=7.5，20 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗脱。将GPt提取过程中过滤后的上清液pH值调至7.5，取3 mL上样，洗脱流速0.8 mL/min，280 nm波长下检测流出液，将吸光度值大于0.2的组分收集起来，用蒸馏水透析3次，经脱盐后的GP各组分冻干备用。另收集峰尖的蛋白溶液，进行SDS-PAGE（5%浓缩胶、15%分离胶）鉴定[7]和MALDI-TOF-MS测定GP分子量[8]。

1.2.3 GP的化学修饰按照Klaymen方法，在氮气的保护下制备1 mol/L NaHSe[9]。用50 mmol/L PBS（pH=7.4）溶解纯化GP各组分，制备浓度0.25 g/L GP溶液，每1mL GP溶液加入12.5µL PMSF（20g/L乙腈溶液），在密闭容器中25℃温水浴3 h，随后通入氮气20 min，达到排除体系内氧气的目的，加入15µLNaHSe溶液，在37℃氮气保护下反应40 h，反应完成后将溶液置于空气中充分氧化，12000 r/min离心20 min除去硒，经SephadexG-25凝胶层析柱除盐后冻干，即得Se-GP。

1.2.4 GP和Se-GP的硒含量和GPX活力分别采用氢化物原子荧光光谱法检测[10]和Wilson的酶偶联方法测定GP、Se-GP的硒含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活力[11]。以150mmol/L PBS（pH=7.4）作为空白对照，在340nm处测定NADPH的吸光度值变化。酶活力的定义为1 min内氧化1µmol/L NADPH所需的酶量为1U，比活力的单位为U/g。

1.2.5 Se-GP清除自由基力的测定配制Ebselen样品（2.5，5.0，7.5，10µmol/L）[12]和不同浓度梯度的硒化植物蛋白样品（25，50，75，100 mg/L）。以Ebselen为对照，分别测定Se-GP对DPPH·、羟自由基（hydroxyl radical，OH·）和超氧阴离子（superoxideanion radical，O-2·）的清除率[13]。

1.2.6 Se-GP对线粒体损伤保护作用的测定采用差速离心法制备牛心线粒体[14]，以少量提取缓冲液悬浮后置于0℃保存，BSA为标准，考马斯亮蓝法测定牛心线粒体浓度[15]。用125 mmol/L KCl、1 mmol/L MgCl2、5 mmol/L谷氨酸盐、1µmol/L GSH的测定缓冲液（pH=7.4）配制终浓度为0.5 g/L的线粒体溶液。37℃保温30 min后，加入终浓度为12.5µmol/L FeSO4和0.5 mmol/L VC，即为线粒体损伤模型。模型建立后立即加入各待测样品（各组分硒化植物蛋白样品的终浓度为50 mg/L，Ebselen样品的终浓度为10µmol/L），在37℃下振荡并记录时间。分别以未加入样品的损伤线粒体为对照和未进行模型损伤的正常线粒体，在0，2，4，6，8，10，15，20 min时间点测定线粒体膨胀度。在520 nm波长下，通过测定溶液吸光度值的变化来判断线粒体的膨胀度，线粒体膨胀时溶液浑浊度增加，A520值下降，即线粒体膨胀度与A520值成反比[16]。

1.3 数据处理

通过3次独立实验测定所有数据，并以平均值±标准差（x±SD）表示。数据及数据间差异采用SPSS 13.0软件进行分析，P＜0.05认为具有统计学差异。

2 结果与讨论

2.1 GP提取和鉴定

采用碱提酸沉法可从100 g糯米中提取6.52± 0.31 g GP（糯米原料的蛋白含量为10.2%，），提取率约为63.9%。经Suphedex G-25凝胶层析分离收集2个主要蛋白峰的GP成分（图1）。收集各峰尖蛋白与粗提GP同时进行SDS-PAGE分析（图2），结果发现碱提酸沉法提取的GP分子量偏小（可能为清蛋白或球蛋白），适于进一步的化学修饰，而不适于化学硒化GP（分子量较大的谷蛋白）在酸碱条件下更易变性沉淀而被去除。再对GP各组分所含主要蛋白的分子量采用MALDI-TOFMS进行分析测定（图3），结果检测到2种主要蛋白并根据测定的分子量分别命名为GP17和GP14。

图1 糯米蛋白的Suphedex G-25凝胶色谱洗脱曲线

图2 糯米蛋白的SDS-PAGE分析

图3 糯米蛋白的MALDI-TOF-MS分析

2.2 GP和Se-GP的硒含量和GPX活力见表1。

表1 各种糯米蛋白和硒化糯米蛋白的硒含量和抗氧化酶活性

实验研究中常以含硒酶GPX的活力来衡量硒蛋白抗氧活力。各组分GP和Se-GP的Se含量和GPX活力见表1。结果表明提取的GP的GPX活力很低，而经过硒化修饰的Se-GP表现出较高的GPX活力，且Se-GP17的GPX活力比Se-GP14略高。这说明Se的存在，可以使蛋白质表现出GPX活力，但活力的大小可能与Se的含量、蛋白质分子量以及蛋白质的空间结构等诸多因素有关[17]。

2.3 GP和Se-GP对自由基的清除

分别检测Se-GP17、Se-GP14、GP17和GP14对DPPH·、OH·、·的清除作用。实验结果表明：以Ebselen为对照，Se-GP17和Se-GP14对DPPH·的清除作用较对应的GP17和GP14分别增强了3.1和2.4倍（如图4）；对HO·的清除作用较对应的GP17和GP14分别增强了3.9和1.1倍（如图5）；对·的清除作用较对应的GP增强了2.7～3.2倍（如图6）。还可以看出Se-GP17对DPPH·、OH·的清除率与对照Ebselen相当，而对·的清除效果优于对照Ebselen。

图4 GP和Se-GP对DPPH·的清除作用

图5 GP和Se-GP对OH·的清除作用

图6 GP和Se-GP对·的清除作用

2.4 硒化糯米蛋白（Se-GP）对线粒体膨胀的抑制作用

建立VC/Fe2+诱导牛心线粒体损伤模型被并检测Se-GP对损伤线粒体的保护作用，深入的研究Se-GP的抗氧化活性。当线粒体受到损伤时，线粒体的形态结构和功能被破坏。结果显示，Se-GP对损伤线粒体膨胀的抑制作用明显高于GP，对损伤线粒体膨胀具有一定的抑制作用，其中Se-GP17的作用最强（图7）。GP和Se-GP对损伤线粒体中MDA也产生抑制作用，线粒体膜受损后可以产生MDA等脂质过氧化产物，MDA含量异常增加会导致细胞损伤。结果显示，GP和Se-GP对损伤线粒体产生MDA均有一定的抑制作用，而且Se-GP对损伤线粒体中MDA产生的抑制作用明显高于GP，其中Se-GP17的作用比较强（图8）。可推断化学修饰后的Se-GP，提高了线粒体抗氧化能力，终止自由基链式反应，达到保护线粒体损伤的目的。

图7 GP和Se-GP对线粒体膨胀的抑制作用

图8 GP和Se-GP对损伤线粒体中MDA含量的抑制作用

3 结论

采用碱提酸沉法提取出GP，并用化学修饰法将经Suphedex G-25凝胶层析分离的GP17和GP14蛋白分别制备成Se-GP17和Se-GP14。且这套工艺操作简单、作用条件温和、具有良好的应用价值。实验结果显示制备的各种Se-GP均具有清除DPPH·、OH·和·自由基的作用，并具有一定的GPX活性。同时通Vc/Fe2+诱导牛心线粒体损伤模型的实验显示，各种Se-GP均能有效地降低氧化损伤所导致的线粒体膨胀率，减弱脂质过氧化反应，维持线粒体形态。实验显示Se-GP17的GPX活力最高，清除自由基的能力最强，保护损伤线粒体的效果最佳。

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Research on Selenide Glutinous Proteins and Their Antioxidant Activity

SUI Chunhong1，LI Xiaona1，XU Yawei2，JI Peng yan1，WANG Cheng1
（1.Jilin Medical University School of Pharmacy，Jilin 132013；2.Jilin Agricultural Science and Technology University School of Bioengineering，Jilin 132101）

Selenide glutinous proteins（Se-GP）were prepared via glutinous proteins obtained by through alkali extraction and acid precipitation were chemically modified，then their antioxidant activities were appraised.The results of the study showed that Se-GP had certain antioxidant activity of glutathione peroxidase（GPX），therein to，GPX activity of Se-GP14 was highest，circa 51.49 U/g.Various Se-GPs could play a scavenging role on 1，1-diphenyl-2-three nitrophenylhydrazine free radical（DPPH·），hydroxyl radical free radical（OH·）and superoxide anion free radical（O-2·）andefficiently maintain morphology and normal function of cardiac mitochondria in bovine to avoid swelling from induced damage of mitochondria by ascorbic acid/ divalent irons（Vc/Fe2+）and decrease the content of the lipid oxidation product malondialdehyde（MDA）.

glutinous protein；selenium；antioxidant activity

S511.2

A

2017-05-08

吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目（2015-405）；吉林市科技创新发展计划项目（20166030）；吉林医药学院大学生创新创业训练计划项目（2016028）

隋春红（1977-），女，黑龙江省哈尔滨市人，副教授，研究方向：食品催化化学。

※为本文通讯作者

责任编辑：吴艳玲