安眠小复方对小鼠促眠作用的机制研究

甘 雨 乔 敏 张 宏△ 范英兰 赵晶凤 刘小虎 包玉龙 武晓琳

1)辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034 2)沈阳二四二医院，辽宁 沈阳 110034

安眠小复方对小鼠促眠作用的机制研究

甘 雨1)乔 敏1)张 宏1)△范英兰1)赵晶凤2)刘小虎1)包玉龙1)武晓琳1)

1)辽宁省中医药研究院，辽宁 沈阳 110034 2)沈阳二四二医院，辽宁 沈阳 110034

目的探讨中药安眠小复方对小鼠脑神经肽P物质(SP)及睡眠相关细胞因子的影响，以揭示其促眠作用机制。方法60只KM小鼠随机分为6组，安眠小复方高、中、低剂量组分别灌胃给予安眠小复方4.16 g/kg，2.08 g/kg，1.04 g/kg，百乐眠组灌胃给予百乐眠胶囊0.28 g/kg，地西泮组灌胃给予地西泮片1.30 mg/kg，连续给药7 d。末次给药30 min后，处死动物，取脑组织，检测小鼠脑内神经肽SP、白介素1β (IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。结果与空白对照组比较，安眠小复方高、中、低剂量组均能明显降低小鼠脑组织中SP含量(P<0.05或P<0.01)和IL-1β含量(P<0.01)；安眠小复方高、中、低剂量组亦能降低小鼠脑组织中TNF-α含量，其中高、低剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论中药安眠小复方可能通过降低脑内SP含量、破坏觉醒中枢同时调节睡眠相关细胞因子而发挥促眠作用。

失眠；中药复方；P物质；白介素1β；肿瘤坏死因子α

随着现代社会生活节奏的日益加快及不健康生活方式的增多，越来越多的人患上了失眠症(包括入睡困难、易醒、早醒等)，长期失眠可使大脑感觉和智力的敏感度下降，甚至引起抑郁及其他精神类疾病[1]。因此，寻求有效的治疗药物迫在眉睫。以安定为代表药虽能起到镇静安眠作用，但需长期服药，并有一定的不良反应，增加了患者的心理负担。中药安眠小复方是由辽宁中医药大学附属二院院内制剂安眠颗粒(2005年获国家发明专利，由黄芩、苦参、石菖蒲等5味中药组成)经组方精简与剂量优化筛选出的新一代复方制剂，其疗效和安全性已得到课题组前期实验验证[2-3]。本实验在此基础上对睡眠相关神经递质和细胞因子进行了研究，旨在进一步揭示其促眠作用神经机制。

1 材料和方法

1．1实验动物昆明种小鼠，SPF级，体质量18～22 g，雌雄各半，由辽宁长生生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(辽)2010-0001。受试动物引进后在辽宁省中医药研究院实验动物中心(许可证号：SYXK(辽)2012-0010)饲养。

1．2药物与试剂安眠小复方由辽宁省中医药研究院药学室提供，批号：20131023；百乐眠胶囊，扬子江药业集团有限公司，批号：13012412；地西泮片，上海信谊药厂有限公司，批号：121201；磷酸盐缓冲液(PBS)，无锡傲锐东源生物科技有限公司，批号：150706。P物质(SP)酶联免疫试剂盒(批号：201506)、白介素1β (IL-1β) 酶联免疫试剂盒(批号：201506)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫试剂盒(批号：201506)均购于美国R&D公司。

1．3仪器SPECTRA MAX 190型酶标仪，美国Molecular Devices公司；XW-80A型漩涡混匀器，上海泸西分析仪器厂；SIGMA 3-18k型低温离心机，德国SIGMA公司；JKDP-2型电热恒温培养箱，厦门医疗电子仪器厂。

1．4方法

1．4．1 分组与给药：取健康SPF级昆明种小鼠60只，按体质量随机分为6组，即空白对照组，安眠小复方高、中、低剂量组，百乐眠组和地西泮组，每组10只。安眠小复方高、中、低剂量组分别灌胃给予安眠小复方4.16 g/kg，2.08 g/kg，1.04 g/kg，百乐眠组灌胃给予百乐眠胶囊0.28 g/kg，地西泮组灌胃给予地西泮片1.30 mg/kg，空白对照组灌胃给予同体积的蒸馏水。连续灌胃给药7 d。

1．4．2 取材：于末次灌胃给药(水)30 min后，将小鼠断头处死，快速取脑组织，除去小脑及延髓，用冷PBS冲洗脑组织表面，再用滤纸吸干，备用。

1．4．3 检测：取脑组织称质量，加9倍量的冷PBS手动匀浆，4 ℃ 15 000 r/min离心10 min，取上清液，按各试剂盒操作步骤处理后，用酶标仪在450 nm波长下依序测量各孔的吸光度(OD值)。采用外标法绘制标准曲线，计算样品的实际浓度。

2 结果

2．1安眠小复方对小鼠脑组织中P物质含量的影响以标准品的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算直线回归方程为：Y=-0.001 69+0.028 8x(R2=0.969)根据回归方程计算各组样品中P物质含量。见表1。结果表明，安眠小复方高、中、低剂量组均能明显降低小鼠脑组织中P物质含量，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。

表1 安眠小复方对小鼠脑组织中P物质含量的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

2．2安眠小复方对小鼠脑组织中IL-1β含量的影响以标准品的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算直线回归方程为：Y=0.174+0.063 7x(R2=0.912)根据回归方程计算各组样品中IL-1β含量。见表2。结果表明，安眠小复方高、中、低剂量组均能明显降低小鼠脑组织中IL-1β含量，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2．3安眠小复方对小鼠脑组织中TNF-α含量的影响以标准品的浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线，计算直线回归方程为：Y=0.240+0.008 78x(R2=0.983)根据回归方程计算各组样品中TNF-α含量。见表2。结果表明，安眠小复方高、中、低剂量组均能降低小鼠脑组织中TNF-α含量，其中高、低剂量组与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 安眠小复方对小鼠脑组织中IL-1β、NF-α含量的影响

注：与空白对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

3 讨论

睡眠的作用机制十分复杂，是一种多系统、多途径、多因子的调节过程，而中药复方具有多成分、多途径、多靶点的作用特点，我们从神经肽P物质和细胞因子两方面着手，探讨安眠小复方改善睡眠的作用机制。

P物质属于一种神经肽类，在中缝核、下丘脑、蓝斑、皮质等部位均有分布，与痛觉调制、心血管活动和胃肠道运动密切相关。近年来，有研究发现其作为内源性物质参与了睡眠—觉醒的调节，特别是在促进觉醒方面发挥了重要作用。Andersen等[4]发现从小鼠侧脑室注射P物质，可显著增加蓝斑区神经元放电，进而导致小鼠睡眠紊乱，觉醒时间延长。Lieb等[5]也发现，健康成人静脉注射P物质可抑制睡眠。本研究中，健康小鼠连续7 d给予安眠小复方后，其脑组织中P物质含量明显降低，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。提示安眠小复方可能是通过降低脑内P物质含量，破坏觉醒中枢，而发挥促进睡眠作用的。

大量临床和实验研究结果表明，细胞因子参与了睡眠活动，是睡眠的重要调节因子之一，其中与睡眠调节关系最为密切的是IL-1β和TNF-α[6]，但具体的调节方向还存在一些争议。有学者研究发现，人为静脉注射(或脑室注射) IL-1β和TNF-α可促进鼠、猫、兔等多种动物自发性睡眠，脑电图显示慢波睡眠时间延长[7]。在对睡眠剥夺动物研究中发现，IL-1β和TNF-α在其脑干、下丘脑内的表达水平均显著升高[8]。在对临床睡眠障碍患者研究中，也发现其血清IL-1β和TNF-α水平升高[9]，给予安眠药物后，IL-1β和TNF-α显著降低。国内对四逆散[10]、枣仁安神颗粒[11]等改善睡眠药物研究也发现，促进睡眠药物可降低全脑IL-1β和TNF-α含量，与本研究结果一致。提示安眠小复方可能通过降低脑组织中IL-1β和TNF-α含量而发挥改善睡眠作用。

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[4] Andersen ML，Nascimento DC，Machado RB，et al．Sleep disturbance induced by substance P in mice[J]．Behavioural Brain Res，2006，167：212-218．

[5] Lieb K，Ahlvers K，Dancker K，et al．Effects of the Neuropeptide Substance P on Sleep，Mood，and Neuroendocrine Measures in Healthy Young Men[J]．NeuroPsychophamacol，2002，27(6)：1 041-1 049．

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[11] 张颖，齐越，吴怡，等．枣仁安神颗粒改善睡眠作用的量效、时效关系及对脑内细胞因子的影响[J]．中国药业，2015，24(2)：32-34．

(收稿2017-02-08)

责任编辑：关慧

Studyonthemechanismofsleepofanti-insomniaChineseherbalcompoundinmice

GanYu*，QiaoMin，ZhangHong，FanYinglan，ZhaoJingfeng，LiuXiaohu，BaoYulong，WuXiaolin

*LiaoningInstituteofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110034，China

ObjectiveTo explore the effect of anti-insomnia Chinese herbal compound on the brain neuropeptide substance P (SP) and sleep related cytokines in mice，in order to reveal its mechanism．MethodsSixty KM mice were randomly divided into 6 groups．The mice in anti-insomnia Chinese herbal compound high，middle and low dose groups were given intragastric Chinese herbal compound 4.16 g/kg，2.08 g/kg and 1.04 g/kg；the mice in Bailemian group were given intragastric Bailemian capsule 0.28 g/kg；the mice in Diazepam group were given intragastric Diazepam tablets 1.30 mg/kg.All groups were administered continuously for 7 days．30 min after the last administration，the mice were killed and the contents of neuropeptide SP，interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in the brain were detected．ResultsCompared with the blank control group，the high，middle and low dose groups of anti-insomnia Chinese herbal compound could obviously decrease the content of SP (P<0.05 orP<0.01) and IL-1β (P<0.01) in the brain tissue of mice．The high，middle and low dose groups of anti-insomnia Chinese herbal compound could also reduce the content of TNF-α in the brain tissue of mice，and the difference was statistically significant between high，low dose groups and control group (P<0.05)．ConclusionAnti-insomnia Chinese herbal compound may be through reducing the content of SP in the brain，damage to the central nervous system，while regulating sleep related cytokines，and play a role in promoting sleep．

Insomnia；Chinese herbal compound；Substance P；IL-1β；TNF-α

R-332

A

1673-5110(2017)19-0029-03

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.19.006

辽宁省科技厅自然科学基金 (No：201602442)

△通信作者：张宏，女，研究员。研究方向：中药复方药理学。Email：zhanghong8163@163.com