高血压脑出血术后痰瘀腑实证血浆代谢组学的检测分析

刘 琪 刘建仁

1)广州中医药大学，广东 广州 510405 2)广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

高血压脑出血术后痰瘀腑实证血浆代谢组学的检测分析

刘 琪1)刘建仁2)△

1)广州中医药大学，广东 广州 510405 2)广州中医药大学第一附属医院，广东 广州 510405

目的从代谢组学层面寻找高血压脑出血术后痰瘀腑实证的本质以及通腑泻热活血合剂治疗作用机制。方法采用氢谱磁共振(1H-NMR)CPMG脉冲序列检测12例高血压脑出血患者的术前及术后第1、3、7、12天血浆样本，每例患者采集5个血浆样本，本实验共收集60个血样本，所有患者的术前、术后第1天、术后第3天、术后第7天、术后第12天各为1组，分为5组，所有患者术后第3天开始服用通腑泻热合剂。对不同组之间代谢产物含量的变化，采用主成分分析(principal components analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-discriminant analysis，PLSDA)，对比观察5组血浆中的磁共振波谱差异情况，分析相应的代谢产物积分值变化情况。最终选择对本次实验贡献值最大的代谢物，将此代谢物和自身前后进行比对，随后运用统计学方法进行检验，对比不同组别之间的血浆代谢物变化差异。结果患者术前、术后第1天、术后第3天、术后第7天、术后第12天中5组血浆代谢谱在对比中出现差异，且具有统计学意义(P<0.05)，在模式识别和主成份进行分析中，结果表明高血压脑出血术后第3天痰瘀腑实证形成，服用通腑泻热合剂前后具有可区分性、可比较性；术前组和术后第1天组患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：丙氨酸、异亮氨酸、α-酮戊二酸、糖蛋白、前列腺素、极低密度脂蛋白。术后第1天组和术后第3天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：γ-氨基丁酸、α-酮戊二酸、甜菜碱、丝氨酸、前列腺素E1、脂蛋白；术后第3天组和术后第12天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：N-乙酰糖蛋白、α-葡糖糖、胆碱、肌醇、亮氨酸、谷氨酰胺。术后第7天组和术后第12天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物2个：N-乙酰糖蛋白、乳酸。结论当高血压脑出血术后痰瘀腑实证形成，服用通腑泻热活血合剂可以改善脑出血后患者体内脂肪含量，更可以改善血糖代谢，稳定细胞膜等，促进已损伤细胞修复。

高血压脑出血；术后痰瘀腑实证；代谢组学

高血压脑出血痰瘀腑实证是一种西医病与证的结合模式。代谢组学在整体研究的同时可以进行精细测量，这是中医证候概念不能从微观上进行解读且难以突破的关键问题[1]。代谢组学研究方法为中医证候的微观解释提供了一种可能的方法。

1 资料与方法

1．1一般资料选取广州中医药大学第一附属医院颅脑科2015-07-01—2016-07-01住院病人12例。纳入标准：(1)符合高血压脑出血的西医诊断标准(参考《王忠诚神经外科学》“高血压脑出血”诊断标准)；(2)符合中医诊断标准(中风-中脏腑痰瘀腑实证)；(3)年龄18～60岁；(4)发病后24 h入院。排除标准：(1)不符合诊断标准者；(2)外伤性颅内血肿；(3)脑血管畸形、动脉瘤破裂所致颅内血肿；(4)出血量<30 mL或>70 mL；(5)小脑、脑干血肿；(6)凝血机制障碍；(7)患者入院时出现生命体征不稳定，呼吸功能变缓等症状；(8)年龄16～60岁；(9)因个人原因中途退出者。

1．2研究方法

1．2．1 治疗方法：每例患者于术后第3天在西医常规治疗的基础上鼻饲或口服通腑活血中药，采用自身前后对比，分析血浆代谢产物的变化。每例患者采血5次(分别为术前、术后第1天、术后第3天、术后第7天、术后第12天)。通腑泻热活血合剂(广州中医药大学第一附属医院颅脑科经验方，主要组方：大黄12 g(后下)，芒硝8 g(冲服)，厚朴14 g，黄连12 g，枳壳12 g，黄柏12 g，牛膝10 g，川芎10 g，当归15 g，桃仁15 g，地龙12 g，赤芍15 g，红花6 g等，加水150 mL，熬制成浓缩液60 mL左右，经鼻饲给药，1次/d，术后第3天给药。

1．2．2 试剂和仪器：(1)试剂：氧化氘别例：氘代水重水(Sigma-Aldrichgon公司)，磷酸盐缓冲液溶液(Sigma-Aldrichgon公司)；(2)所选仪器为BrukerAvance-500 MHz氢谱磁共振波谱检测仪(由Bruker公司生产)和MiniSpinPlus微型高速度离心机(由德国Eppendorf公司生产)。

1．2．3 血浆代谢组学检测：12例患者分别于术前30 min，术后第1天、第3天、第7天、第15天，抽取肘静脉血3 mL，肝素钠抗凝，在4 ℃下4 000 r/min离心10 min。取上清血浆1.5 mL转移至2 mL抗凝EP管中，-80 ℃冰箱保存备用。在对1H-NMR谱进行采选样本前，将每一管冷冻储存的血浆进行解冻，随后各取每一管血浆中的300 μL血浆，将其放置在磁共振测试管(5 mm直径)中，随后分别在12支磁共振测试管中添加磷酸溶液，剂量为每0.2 mol/L，pH值为7.4，随后再添加200 μL和重水50 μL至磁共振管血浆样品中，充分振荡混匀。30 min后，行氢谱磁共振检测(HNMR)，得到1H-NMR谱图。

1．3数据处理磁共振数据处理：磁共振图谱采用MestReNova 5.3.1 进行自动基线及相位调整后，以0.02 ppm积分段对化学位移区间δ 0.5～8.5 ppm进行分段积分，其中δ 4.7～5.15(残余水峰)不积分。整张谱图的峰面积归一到100，最后得到二维数据矩阵。多元统计学分析：采用R语言和SPSS 20.0软件，通过t-test的P值和PLSDA的VIP值找出相对应的差异化学位移(ppm)。

2 结果

2．1各组血浆代谢轮廓比较高血压脑出血术前、术后第1天、术后第3天、术后第7天、术后第12天的磁共振波谱分别如图1所示，其中横坐标是化学位移，纵坐标是图谱积分值，经过对比每一组的波谱代谢物，可以分析每一组波谱代谢物的差异，最终得出对本次实验影响最大的代谢物。

2．2波谱的主成分分析将以上5组磁共振波谱进行主成份分析(即PCA分析)。图2是对12例患者HICH术前和术后第一天所得波谱中第一、二主成份显示的Sore图，上图中的每一个小点代表的是进行测试的血浆样品。如1-1表示编号为1的一个患者的术后第1天血浆样品，1-0表示编号为1的患者，术前的血浆样品。结果示，主成分分析积分值集中分布于椭圆得分图的2个区域，术前组位于左边，术后第1天位于右边。2组区域完全分开，说明术前和术后第1天2组血浆在代谢组学成分上有明显差异。说明手术打击影响代谢物的变化。PLSDA对应的第一、二主成分的 Loading 图，图中PLSDA的点大部分落坐标(0，0)附近，易于发现差异代谢物。离(0，0)越远的点表明其对分类贡献较大，表明其主成分的相关性越好，越有可能是实验研究所需，越集中的点差异越小。PCA-Loding图中，3.748 12、2.625 31、2.525 06、2.505 01、3.788 22、2.665 41、3.647 87等7个数据化学位移对应的化学成分对本次实验影响最大，贡献值也最大。本研究根据两两t检验的P值和PLSDA的值在主成分1上的VIP值进一步筛选差异标记物。如果出现P<0.05，在主成分1上的VIP值>1，也就是我们选出来的差异性位移，就在那个离(0，0)点比较远位置的点，那就很理想。

图1 各组1H-NMR波谱叠加图

术后第1天和术后第3天2组完全分开，一个位于左上区域，一个位于右下区域，说明术后第1天和术后第3天2组血浆在代谢组学成分上有明显差异。PCA-Loding图中，1.221 8、4.690 48、4.670 43、3.788 22、1.261 9等化学位移对应化学成分可能对实验结果贡献值最大。

术后第3天组和术后第7天组2组区域不能完全分开，通过P值和VIP值不能筛选出差异性代谢产物，2组血浆在代谢组学成分上无明显差异。因是凌晨采血，术后第7天为服用通腑泻热合剂后第4天，受术后控制出入量、脱水等影响，中药药效对血浆代谢物的改变不明显。见图4。

图2 术前组和术后第1天组患者血浆PLSDA分析的Score图、Loading图

图3 术后第1天和术后第3天患者血浆PLSDA分析的Score图、Loading图

术后第7天组和术后第7天组2组区域完全分开，2组血浆在代谢组学成分上有明显差异，PCA-Loding图中，1.302 01、1.261 9、0.860 92、3.788 22、3.748 12等5个数据对本次实验结果的贡献值最大。见图5。

术后第3天组和术后第12天组的主成分的Score图如图6所示，术后第3天组和术后第12天组2组区域完全分开，服用通腑泻热中药和服药后第10天2组血浆在代谢组学成分上有明显差异，PCA-Loding图中，1.302 01、3.768 17、4.670 43、3.788 22、1.261 9等化学位移对应化学成分可能对实验结果贡献值最大。

图4 术后第3天和术后第7天患者血浆PLSDA分析的Score图

图5 术后第7天和术后第12天患者血浆PLSDA分析的Score图、Loading图

2．3代谢物的含量变化对本次实验的结合代谢物的VIP值和归一化积分值运用统计软件进行统计分析，鉴定归一化积分和其化学位移值代表的代谢物差异情况。本次实验中的代谢物成分鉴定采用人类代谢产物数据库进行查阅。从表4中可见，术前组和术后第1天组pH患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：丙氨酸、异亮氨酸、α-酮戊二酸、糖蛋白、前列腺素、极低密度脂蛋白。在有效治疗的12例患者术后第1天和术前相比：丙氨酸水平下降，异亮氨酸、α-酮戊二酸、糖蛋白、前列腺素、极低密度脂蛋白水平上升。

图6 术后第3天和术后第12天患者血浆PLSDA分析的Score图、Loading图

表4 术前组和术后第1天组差异性代谢物

从表5中可见，术后第1天组和术后第3天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：γ-氨基丁酸、α-酮戊二酸、甜菜碱、丝氨酸、前列腺素E1、脂蛋白。12例患者术后第3天和术后第1天相比：γ-氨基丁酸水平上升，α-酮戊二酸、甜菜碱、丝氨酸、前列腺素E1、脂蛋白水平下降。

表5 术后第1天组和术后第3天组差异性代谢物

从表6中可见，术后第3天组和术后第12天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物6个：N-乙酰糖蛋白、α-葡糖糖、胆碱、肌醇、亮氨酸、谷氨酰胺。服用中药后(术后第3天至术后第12天)血浆代谢物变化可见，中药通腑泻热活血合剂的早期应用可使得血浆中亮氨酸、肌醇、胆碱(Cho)、谷氨酰胺、α-葡糖糖水平下降、N-乙酰蛋白水平上升。

表6 术后第3天组和术后第12天组差异性代谢物

从表7中可见，术后第7天组和术后第12天组中患者血浆中差异较大的特异性代谢物2个：N-乙酰糖蛋白、乳酸。12例患者术后第12天和术后第7天相比，乳酸、N-乙酰糖蛋白水平上升。

表7 术后第7天组和术后第12天组差异性代谢物

3 讨论

本研究所采用的通腑泄热活血合剂是广州中医药大学第一附属医院颅脑科经验方，此方生大黄为其主药，功效：(1)通腑泻热消痞：大黄其性大苦大寒，有泻下攻积、清热泻火、荡漆肠胃之功用。其有效成分蒽醌衍生物，双蒽醌中有番泻苷，具有泻下的功效。(2)泻热破结逐瘀：大黄气香走窜，入血能通瘀破结，使瘀、热、结一举而去，大黄中的有效成分大黄素具有明显的抗水肿作用；大黄多糖可抑制 Ca2+内流，阻断神经元细胞内 Ca2+超载，降颅压作用较为显著[2]。芒硝具有泻下攻积、软散结之功，配生大黄可增强泻下通便、通腑降气的作用。佐以厚朴下气除满、枳实行气消痞，合而用之，既能消痞除满又能使胃肠气机通降下行以助泻下通便。活血化瘀中药在中风急性期的应用得到了诸多学者的高度认可，认为其有促进神经功能恢复、持续稳定降压、改善血液高黏滞状态的作用。因此，本方在大承气汤的基础上，加用活血化瘀中药：桃仁、红花、牛膝，当归、川芎，辛香温润，能养血而行血中之气而流动之，赤芍清热凉血。风邪也是屮风的致病及发展过程中的重要因素，因此加以虫类药地龙息风通络。黄连、黄柏清热泻火。此方中诸药合药，则可达上下通利之效。

术前组和术后第1天组：丙氨酸参与了机体的免疫功能，丙氨酸的含量相对减少，说明高血压脑出血术后，免疫力相对较低下，推测葡萄糖-丙氨酸循环存在循环障碍。异亮氨酸够更快分解转化为葡萄糖，前列腺素广泛分布于人脑组织，其能增强肾上腺交感活动，通过兴奋中枢交感系统对肾上腺的作用使血糖浓度升高。而大脑主要是利用血液提供的葡萄糖供能，异亮氨酸、前列腺素水平的增加，表明手术应激使脑组织处于一种高能耗状态。α-酮戊二酸是三羧酸循环中的另一种关键物质，这一结果提示机体能量消耗较大，为了满足机体需要三羧酸循环处于较高水平，是一种能量代谢紊乱的状态。同时VLDL水平升高，这些差异代谢物与脂肪酸、糖异生、丙氨酸循环等多个代谢通路相关。

术后第1天组和术后第3天组：前列腺素E1是人体血管内皮组织上产生的血管舒张剂，它可以刺激腺苷酸环化酶系统使血管内的平滑肌松弛[3]。此外，前列腺素E1更可以改善血管血液循环，抑制血小板聚集，防止血块形成。术后第3天前列腺素E1水平下降，说明脑血管收缩，脑组织处于缺血缺氧状态，处于水肿高峰期。谷氨酸是由氨和人体脑细胞中的α-酮戊二酸结合而成，而在合成谷氨酸的过程中，需要大量的消耗α-酮戊二酸。α-酮戊二酸主要是三羧酸经过循环后得到的产物，如果α-酮戊二酸减少，那么三羧酸就不能维持正常的循环代谢运行，随着ATP的减少，也就不能维持人脑正常运行，最终会导致人发生昏迷。术后第3天患者处于水肿高峰期，出现意识障碍或意识水平下降可能与血液中氨浓度过高、氧利用率下降、产能减少有关。研究表明，丝氨酸可以提高人的认知能力，特别是在学习和记忆这一方面，可以提高学习能力和记忆力。人大脑中包含着大量的脂质组织，磷脂是脂质组织的一种，磷脂酰丝氨酸作为磷脂的一种尤其重要，除可提升人的记忆力，更可以提高人的思维分析能力。丝氨酸水平下降，表明患者认知能力下降。γ-氨基丁酸有突触后抑制的作用，是中枢神经系统中重要的抑制性递质，能够对抗谷氨酸的兴奋性毒性，术后第3天服用通腑泄热合剂后γ-氨基丁酸水平上升。

术后第3天组和术后第12天组(服用通腑泄热活血合剂后)：在人脑缺血和再次灌注的环节中，神经细胞的死亡是关键环节，这一环节直接影响患者的预后。不少研究表明，当人脑出现缺血时，就会出现神经功能异常，而伴随着神经功能的异常，人脑释放的氨基酸谷氨酸就会随之增多，脑细胞外的Glu 浓度也随之上升[4]，Glu 浓度上升之后会导致脑组织进一步损伤，由此可知，在脑损伤的这一环节中，主要由Glu发生作用，Glu产生的持久性兴奋突触后电位，最终导致脑神经细胞的死亡[5]。Glu形成的前提物质是Glu-谷氨酰胺[6]，而这一前提物质主要存在星形胶质细胞中，当Glu-谷氨酰胺进入神经细胞线粒体后参与氮自由基的合成，最终就形成了Glu[7]。Glu的增加会促进神经细胞损伤，因此，过度的水解Glu使脑神经细胞损伤[8]。术后12 d，服用中药后9 d，谷氨酰胺水平下降，说明通腑泄热活血中药在一定程度上可以阻止星形胶质细胞内 Glu-Gln的形成循环，最终发挥保护脑组织的作用。大量研究表明[9]，下丘脑上的肾上腺皮质激素循环释放的激素会受到亮氨酸水平控制，研究表明亮氨酸是决定外周脂质和能量代谢变化的最终因子。亮氨酸水平下降说明脂质代谢水平下降，加之α-葡糖糖水平也下降，说明服用通腑泄热活血中药后，能量代谢紊乱状态得到有效纠正。

术后7 d组和术后12 d组(服用通腑泄热活血合剂后)：许多年来，乳酸的堆积被认为是脑缺血缺氧下下脑组织损伤的主要原因之一，然而近年的研究发现[10]：乳酸是联系脑能量代谢和功能活动的重要物质，是神经元低氧后功能恢复的必需底物，在脑缺血情况下抑制神经元的乳酸摄取导致神经元损伤加重。有研究发现，乳酸在兴奋毒性模型中对神经元具有重要的保护作用，与仅有葡萄糖的情况相比，神经元在乳酸存在的条件下能够相对较快地恢复功能[11-12]。服用通腑泄热活血中药后乳酸水平升高，表明中药可能对神经元的能量代谢稳态的维持及神经元的生存具有重要意义。

代谢组学是一种新兴的疾病诊断方法，对疾病状态下生物化学途径的改变有着深入的认识。代谢产物在脑血管疾病中起关键作用。本研究中，使用NMR光谱分析患者血清以鉴定潜在的高血压脑出血继发性损害及通腑泻热活血合剂的作用标记物存在诊断意义。

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(收稿2017-07-07)

责任编辑：张喜民

DetectionanalysisofPhlegmandStasisFu-organSyndromeaftertreatmentofhypertensivecerebralhemorrhagethroughmetabonomics

LiuQi*，LiuJianren

*GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine，Guangzhou510405，China

ObjectiveTo find out the essence of Phlegm and Stasis Fu-organ Syndrome and the function of mixture for purging diarrhea and activating blood circulation through metabonomics after treatment of hypertensive cerebral hemorrhage．MethodsCPMG sequential detection of hydrogennuclear magnetic resonance(1H-NMR) was applied to test the plasma samples of patients before treatment and one day，seven days and twelve days after treatment of hypertensive cerebral hemorrhage．Five plasma samples were collected from each patient．Sixty plasma samples were collected for this research in total．There were five groups：plasma samples before treatment，one day，three days，seven days and twelve days after treatment．All the patients were asked to take the mixture for purging diarrhea and activating blood circulation．Content changes of metabolite in different groups were analyzed through principal components analysis(PCA) and PLS-discriminant analysis (PLSDA)．NMR difference of the five groups of plasma samples and integral value of relevant metabolite were also analyzed．Metabolite with the greatest contribution for the research was chosen at last．ResultsDifference of plasma metabolization profiling in the five groups was statistically significant with(P<0.05)．During the analysis process of pattern recognition and principal components，it was found that Phlegm and Stasis Fu-organ Syndrome formed three days after treatment．The results were distinguishable and comparable before and after taking mixture for purging diarrhea and activating blood circulation．There were six specific metabolites in the pre-operation group and the group one day after operation．They were alanine，isoleucine，α-oxoglutarate，glycoprotein，prostaglandin and very low density lipoprotein．There were six specific metabolites in the groups one day and three days after operation．They were γ-aminobutyric acid，α-oxoglutarate，betaine，serine，prostaglandin-E1 and lipoprotein．There were also six specific metabolites in the groups three days and twelve days after operation．They were N-glycoprotein，α-glucose，choline，inositol，leucine and glutamine．There were two specific metabolites in the groups seven days and twelve days after operation．They were N-glycoprotein and lactate．ConclusionWhen Phlegm and Stasis Fu-organ Syndrome forms after treatment of hypertensive cerebral hemorrhage，taking mixture for purging diarrhea and activating blood circulation can improve fat content and metabolism of the patients．It can also stabilize patients’ cytomembrane and help injured cells recover．

Hypertension brain hemorrhage；Postoperative Phlegm Stasis；Metabolomics；detection

R743.34

A

1673-5110(2017)19-0010-08

10.3969/j.issn.1673-5110.2017.19.003

广东省科技计划项目，编号：2013B021800166

△通信作者，刘建仁(1972—)， 男，医学博士，主任中医师。 研究方向：中西医结合治疗脑血管疾病的基础和临床。Email：liujianren999@163.com