神经型一氧化氮合酶参与脂多糖诱导的大鼠脑微出血的相关性研究

曾 静， 李丹丹， 刘志新， 赵弘轶， 迟丽屹， 黄勇华

神经型一氧化氮合酶参与脂多糖诱导的大鼠脑微出血的相关性研究

曾 静1，2， 李丹丹1， 刘志新3， 赵弘轶1， 迟丽屹4， 黄勇华1

目的改进并稳定脂多糖(LPS)诱导脑微出血(CMBS)动物模型的建立方法，为进一步研究提供稳定成熟的技术手段；探讨神经型一氧化氮合酶(nNOS)在CMBS过程中的作用。方法40只SD大鼠，随机分成LPS给药组(n=20)和生理盐水对照组(n=20)，分别于0 h、12 h和24 h腹腔注射1 mg/ml、3 mg/kg LPS或相同剂量的生理盐水，48 h后行头部MRI扫描，SWI序列显示出血灶；免疫荧光染色显示小胶质细胞标记分子Iba的表达；蛋白印迹法分析nNOS和ZO-1(血脑屏障标记分子)的表达情况。结果3 mg/kg LPS给药后，MRI显示散在SWI序列点状低信号影，蛋白印迹法及免疫荧光结果显示ZO-1明显减少，Iba及nNOS表达显著增多。结论LPS可能通过增加全身炎症反应，促进脑内小胶质细胞增殖，增加nNOS的表达，对中枢神经系统血脑屏障产生破坏作用，从而导致微出血的产生。

脑微出血； 脂多糖； 神经型一氧化氮合酶； 磁敏感加权成像； 血脑屏障

脑小血管病(cerebral small vessel disease，CSVD)是指在多种病因共同作用下，导致脑的穿支动脉、小动脉(直径40～200 μm)、毛细血管和小静脉受损，进而损伤脑深部灰质和脑白质，进而出现一些特征性的病理学和影像学改变以及认知功能障碍的临床综合征[1]。其影像学改变主要包括新发的皮质下梗死、可能为血管起源的腔隙、可能为血管起源的白质高信号、血管周围间隙扩大、脑萎缩以及脑微出血[2]。

脑微出血(cerebral microbleeds，CMBS)是脑内微小血管破裂导致的微小出血，病理上表现为受损血管周围小的陈旧性出血灶以及含铁血黄素沉积[3]。然而，这种出血灶在常规的影像学检查上难以发现，较多的研究显示，磁敏感加权成像(SWI)显示CMBS的敏感性明显优于常规序列，显示出较高的临床应用价值[4]。CMBS在SWI上表现为多发性小灶性(<10 mm)的信号缺失，周围没有水肿形成。关于CMBS，目前认为，炎症反应是其重要的发病机制之一[5]。

神经型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)是NOS3种亚型之一，又称为NOS1，在中枢和外周的神经元持续表达，具有调节中枢神经系统突触可塑性、调节血压、松弛血管平滑肌、舒张血管等作用[6]。nNOS为Ca2+依赖型，高活性的nNOS，刺激大量的Ca2+内流，激活NMDA受体介导神经细胞凋亡[7]。

脂多糖(LPS)是革兰阴性细菌细胞壁的组成成分之一，是一种良好的炎症刺激因子。Sumbria等[8]通过 C57BL/6小鼠腹腔注射LPS构建脑微出血动物模型。本课题参考并改进该方法建立SD大鼠脑微出血动物模型，并探讨nNOS在脑微出血病理进程中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料 雄性清洁级SD大鼠，体重(220±20)g，购于斯贝福实验动物科技有限公司；7.0T核磁(BioSpec，首都医科大学)；脂多糖(086M4159V，Sigma)；NOS1(A-11)(sc-5302，SANTA CRUZ)；ZO-1 Polyclonal ANTIBODY(21773-1-AP，proteintech)；Anti-Iba1 antibody(ab178847，abcam)；Mouse anti β-tubulin antibody(GB13017-2，谷歌生物)；HRP标记的山羊抗小鼠IgG(GB23301，谷歌生物)；Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(M21002，Abmart)；Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG(H+L)(A0423，碧云天)。

1.2 分组处理 配制1 mg/ml的脂多糖。将40只雄性SD大鼠，随机分成LPS给药组(n=20)和生理盐水对照组(n=20)，LPS给药组从第一天晚上20：00开始，分别于0 h、12 h、24 h后腹腔注射LPS 3 mg/kg，对照组给予等量生理盐水。

1.3 MRI LPS给药后48 h，采用7.0T核磁进行头部冠状位全层扫描，层厚为0.7 mm，SWI序列评估微出血的部位及数目。

1.4 免疫荧光 LPS给药后48 h，每组各取10只大鼠，4 ml/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，依次经心脏灌注生理盐水300 ml、4%多聚甲醛溶液300 ml，完整取出脑组织，依次置入4%多聚甲醛溶液、20%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液各6 h固定脑组织，然后进行冰冻切片，厚度为10 μm，每隔100微米取一层。采用免疫荧光的方法标记小胶质细胞的特异性标记物Iba，确定LPS诱导的脑微出血炎症反应的程度。其中一抗为Anti-Iba1 antibody(1∶100);二抗为Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔IgG(1∶500)，DAPI对细胞核进行染色。

1.5 蛋白印迹法 LPS给药后48 h，每组各取10只大鼠，足量水合氯醛充分麻醉，快速取出脑组织，然后取额叶、基底节、小脑对应部位等量大小的脑组织，立即置于液氮中保存，需要时采用匀浆器充分研磨脑组织，加入RIPA裂解液(PMSF与RIPA Lysis Buffer按1∶500配制)冰上孵育30 min，4 ℃、12000 rpm离心15 min，取上清，加入上样缓冲液，混匀后煮沸10 min，然后按蛋白印迹法的操作步骤进行，一抗为nNOS(1∶200)和ZO-1(1∶1000)，内参为β-tubulin(1∶2000);二抗为Goat Anti-Rabbit IgG-HRP(1∶4000)和HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶4000)。利用BIO-RAD XRS+Software显影，采用Image J图像分析软件对显影结果进行灰度分析。

2 结 果

2.1 死亡率 给药后48 h，LPS给药组大鼠死亡2只，存活率为90%，对照组因麻醉意外死亡1只。因灌注失败LPS给药组和空白组各死亡1只。

2.2 脑表面微出血 给药后48 h，LPS给药组经过生理盐水及多聚甲醛灌注后的脑组织表面微出血数目为(5.4±1.2)个，显著高于生理盐水对照组(P<0.01)(见图1)。

2.3 MRI LPS或生理盐水给药后48 h，MRI的SWI序列，微出血在SWI序列上呈点状低信号，LPS给药组在SWI序列上低信号的数目为(8.5±0.9)，显著高于生理盐水对照组(P<0.01)(见图2)。

2.4 免疫荧光 免疫荧光结果显示，相同部位，LPS给药组小胶质细胞特异性标记分子Iba的数目为36.30±3.59，生理盐水对照组为16.30±3.09，LPS给药组显著高于对照组(P<0.01)(见图3)。

2.5 蛋白印迹法 蛋白电泳结果显示，与生理盐水对照组相比，额叶、基底节、小脑3个部位的LPS给药组血脑屏障标记分子ZO-1均明显减少(P<0.01)，nNOS表达均显著增加(P<0.01)(见图4)。

图1 灌注后的脑组织，左侧为对照组，右侧为LPS给药组，箭头所指为脑表面微出血

图2 左侧为生理盐水对照组，右侧为LPS给药组，箭头所指即为微出血的部位

图3 左侧上为生理盐水对照组，右侧上为LPS给药组，蓝色荧光为DAPI，绿色荧光为Iba阳性小胶质细胞标记物

图4 额叶、小脑、基底节3个部位对应的ZO-1、nNOS分别与内参β-tubulin的灰度比值

3 讨 论

脑微出血是脑小血管病的表现形式之一，是脑内基底核区或皮质下微血管破裂所致的脑实质损害，大多数患者无临床症状，但CMS却有很高的发病率。丁健等[9]通过对285例急性脑梗死患者研究显示，急性脑梗死伴CMS的患者占37.5%。而无症状或健康老年人群CMS患病率约为5%～6%[10]。CMS的发病机制目前还不十分清楚，很多研究表明炎症反应在其发生发展过程中发挥着重要作用，Mitaki等[11]通过对519个神经功能正常且没有任何神经系统或精神疾病病史的受试者研究表明，CMS与血清C-反应蛋白(CRP)增高相关。Shoamanesh等[12]对15种炎症标志物与脑小血管病的相关性研究表明，循环中高水平的肿瘤坏死因子2(TNFR2)和髓过氧化物酶与CMS相关，且不同的炎症通路可能会导致缺乏或出血不同的表现。

最近的研究表明，血管内皮细胞不仅可以表达内皮型一氧化氮合酶，还可以表达nNOS，表达于血管内皮细胞的nNOS具有维持心血管系统稳定重要作用[13]。在生理条件下，nNOS的表达产物除了一氧化氮，还可以产生一些非神经细胞信号物质如过氧化物、超氧化物等[14]。在体内，nNOS有单体和二聚体两种形式混合存在，二聚体是其活性形式，四氢生物蝶呤(BH4)和L-精氨酸是其形成的必要物质，缺乏BH4或者L-精氨酸会导致nNOS解偶联，从而增加超氧化物的产生[15]。

通过本次研究，我们改进并稳定了脂多糖快速诱导脑微出血的大鼠模型，通过大体标本、HE染色、MRI的SWI序列均表明脑内及脑表面有微出血的存在。全身炎症反应或者炎症相关标记物的增加与正常老化[16]、脑卒中[17]、高血压[18]等有显著的相关性。急性炎症可以导致内皮细胞损伤和血脑屏障破坏[19]。LPS通过增加全身炎症反应，促进小胶质细胞增生，对血脑屏障的结构和功能产生破坏作用，从而导致微出血的产生。本研究中，我们发现，生理条件下nNOS的表达很少，而在LPS诱导的CMBS的病理过程中，nNOS活性显著增强，参与CMBS的形成。

但是，就目前的研究而言，nNOS活性增强和脑微出血之间的因果关系及二者之间相互作用的机制都不十分清楚，后续实验将围绕这两方面的问题展开研究，希望对CMBS有更进一步的认识。

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Neuronalnitricoxidesynthaseisinvolvedincerebralmicrobleedsinducedbylipopolysaccharideinrats

ZENGJing，LIDandan，LIUZhixin,etal.

(ArmyGeneralHospitalofPLA，Beijng100700，China)

ObjectiveTo improve the method of cerebral microbleeds(CMBS) model induced by lipopolysaccharide (LPS) and investigate the effect of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in CMBS.MethodsAnimals were classified into two groups:LPS treatment group (n=20) and saline control group (n=20).LPS group were treated with 1 mg/ml,3 mg/kg,LPS or the same dose of saline by intraperitoneal injection on 0 h、12 h and 24 h.After 48 h,head MRI scan,SWI sequence showed microbleeds.Immunofluorescence staining showed that the expression of microglia marker Iba.Western blot analysis the expression of nNOS and ZO-1 (molecular markers of the blood brain barrier).ResultsAdministration of 3 mg/kg LPS group appeared point low signal in the SWI sequence.Western blot and immunofluorescence showed that ZO-1 significantly reduced while Iba and nNOS expression increased significantly.ConclusionLPS may increase the systemic inflammatory response,promote the proliferation of microglia in the brain,increase the expression of nNOS,and destroy the blood-brain barrier of the central nervous system,leading to the occurrence of CMBS.

Cerebral microbleeds; Lipopolysaccharide; Neuronal nitric oxide synthase; SWI; Blood-brain barrier

R743.34

A

1003-2754(2017)10-0868-04

2017-08-14；

2017-10-03

(1.中国人民解放军陆军总医院神经内科，北京 100700；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046；3.北京四环制药有限公司，北京 101113；4.中国人民解放军第四五一医院神经内科，陕西 西安 710054)

黄勇华，E-mail：huangyh@163.com