大尺寸骨软骨复合支架修复羊膝关节骨软骨缺损的初步研究*

边卫国，钟 亮，连 芩，邱裕生，靳忠民

1.西安交通大学第一附属医院(西安710061)，2.西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室(西安710028)

△通讯作者

大尺寸骨软骨复合支架修复羊膝关节骨软骨缺损的初步研究*

边卫国1，钟 亮1，连 芩2△，邱裕生1，靳忠民2

1.西安交通大学第一附属医院(西安710061)，2.西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室(西安710028)

目的：利用山羊膝关节大面积骨软骨缺损模型评价大尺寸仿生水凝胶/聚乳酸/β-磷酸三钙(PEG/PLA/β-TCP)复合支架软骨再生修复效果和安全性。方法：选取约1岁龄健康雄性关中山羊3只，体重为35～40 kg，采用开放手术方式，将支架植入缺损区，术后当天及术后6月X线检查；术后观察动物功能康复；术后12月处死动物，并进行大体标本评测，组织学检测，根据国际软骨修复协会(ICRS)大体评估及组织学评分标准进行量化评分。结果：术后动物无感染和死亡，术后2周术侧肢体自然负重行走，术后12月，术侧肢体行走、奔跑与对侧相似，无明显跛行。术后6月X线示大尺寸PEG/PLA/β-TCP复合支架仍然固定良好，未出现支架破碎崩解等现象。术后12月，术侧膝被动屈、伸运动范围与对侧肢体相似。大体观察术侧膝关节骨软骨缺损被新生修复组织填充，与周围正常组织连接，高度基本持平。但修复表面呈纤维化表面和小区域瘢痕组织及裂痕。ICRS软骨修复大体评分分别为6、9、8分。组织学染色及Ⅱ型胶原免疫组化示：新生修复组织表面凹凸不平，缺损修复内可见纤维软骨细胞与部分透明软骨细胞，基质染色淡，软骨层与软骨下骨交界区整合连续性较差，Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性。V-G染色示TCP骨支架周围及其内部有新生胶原纤维长入。结论：大尺寸PEG/PLA/β-TCP复合支架植入山羊膝关节缺损处后具有良好的固定性及组织相容性。支架的仿生设计和固定装置为植入初期提供了良好的力学支持，后期可诱导周围细胞的迁徙与增殖。术后骨软骨缺损被新生软骨样组织填充，手术膝关节功能长期良好。

关节软骨是一种缺乏血供、神经支配、自我增殖更新能力弱的稳定组织，一旦由于感染、创伤等因素造成关节软骨的破坏，难以通过自身能力进行修复、再生[1]。目前针对关节骨软骨损伤的临床治疗方法和研究有很多，微骨折术、钻孔术、骨软骨移植等[2-4]。但各治疗方式的修复效果无法令人满意及尚存在着许多不足。本研究采用一种大尺寸仿生水凝胶/聚乳酸/β-磷酸三钙(PEG/PLA/β-TCP)复合支架，利用该支架一体化的仿生设计，在不添加、负荷任何种子细胞及细胞因子的基础上，植入动物模型，对山羊膝关节大面积骨软骨缺损进行再生修复，初步探讨及评估该大尺寸复合支架对关节骨软骨缺损的再生修复效果。

材料与方法

1 实验材料 选取12月龄健康雄性关中山羊3只，体重 35～40 kg，动物实验经西安交通大学第一附属医院实验动物实验管理委员会批准，实验实施遵循《实验动物保护与应用指南》。大尺寸水凝胶/聚乳酸/β-磷酸三钙复合支架(大尺寸PEG/PLA/β-TCP复合支架，见图1)由西安交通大学机械制造系统工程国家重点实验室连芩教授提供。PEG软骨支架厚3.5 mm；β-TCP骨支架为20 mm×15 mm×10 mm；PLA固定桩高22 mm，直径4 mm。生物陶瓷支架内部含有初级管道和次级管道直径0.5 mm，初级管道供细胞黏附及组织长入；次级管道用于灌注PLA，提高β-TCP支架的力学强度；PEG软骨支架通过水凝胶管道与β-TCP骨支架结合。

图1 大尺寸PEG/PLA/β-TCP复合支架实物图

2 手术操作及术后护理 行右膝前正中切口，内侧切开关节囊，逐层切开，使髌骨向外侧脱位，显露股骨内侧髁，将软骨截骨导板安置于右膝股骨内侧髁，确定支架植入位置(见图2 A)。用摆锯沿划线位置进行切割，制造出与支架大小及外观一致的大面积骨软骨缺损，缺损范围约15 mm×20 mm，深约10 mm。缺损处安放试件(见图2 B)。利用标配钻头通过导板上的两个定位孔进行打孔(深约10 mm，直径约4 mm)。去除残留的软骨碎片及骨屑，生理盐水冲洗(见图2C)。将已消毒的浸泡在PBS中的支架通过压配方式植入制备的骨软骨缺损处，确保植入后复合支架高度与周围正常软骨表面平齐(如图2D)。髌骨复位，检查膝关节活动及髌骨轨迹有无异常，植入物有无脱落。依次关闭伤口。术后分栏饲养，术后每天给予肌注青霉素1次(5～10万U/kg)预防术后伤口感染。

A：暴露内侧髁按照模具划定缺损范围；B：截骨；

3 术后检测 密切观察实验动物的精神、饮食、切口愈合情况及膝关节活动情况。术后当天及术后6月行患肢膝关节X线检查，观察支架植入固定情况。术后12月处死动物，离断的双侧后肢(支架植入侧肢体为实验组，对侧膝关节肢体为对照组)。之后打开关节腔，观察有无积液，滑膜、半月板及缺损修复区域的大体情况，根据ICRS软骨修复大体评估标准进行评分。以股骨内侧髁骨软骨缺损处为中心，用电锯采集新生软骨及软骨下骨的骨软骨块(约2 cm×2 cm×2 cm大小)，放入10%中性福尔马林中固定，而后分别进行HE染色、甲苯胺蓝染色、番红O染色、免疫组化染色、V-G染色。

结 果

1 术后一般情况及软骨修复大体评分 术后2周活动基本接近正常，手术切口愈合良好，术侧膝关节未见感染。术后12月术侧膝关节主被动伸直、屈曲运动、活动范围与对侧膝关节基本一致；关节周围皮肤无红肿及异常分泌物；打开关节囊，可见关节囊无增厚或挛缩、髌骨无脱位、关节腔内无感染及渗出、滑膜无粘连(见图3)。ICRS软骨修复大体评分，见表 1。

2 术后X线检查结果 术后当天X线片检查示：植入物固定牢靠，无脱出、变形；动物膝关节骨性结构对合良好；术后6月X线检查示：支架在股骨内侧髁固定良好，外形存在，无脱出、无崩塌变形；术侧膝关节间隙存在，骨性结构对合良好，关节腔内无异物、无骨赘形成。见图 4。

图3 大体标本观察

实验动物大体评估分值总体修复评估山羊A6Ⅲ级：异常山羊B9Ⅱ级：接近正常山羊C8Ⅱ级：接近正常

A：术后当天；B：术后6月

3 术后组织学结果 术后12月，实验组标本组织学染色示组织标本着色可，新生软骨修复组织表面不平整，厚度较周围正常软骨薄，部分修复组织可见裂隙、凹陷；修复组织以透明样软骨和纤维软骨混合而成，细胞排列欠规整。实验组有新生的软骨下骨形成，并逐渐向缺损中心相互靠近，有类似于正常软骨下骨的骨板结构形成。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性(见图5)。V-G染色结果：骨组织内可见部分未被吸收、残留的TCP陶瓷支架，其内及周围有大量新生胶原纤维的长入(见图 6)。

A：HE染色40×；B：番红O染色40×；

A：正常松质骨40×；B、C、D： 植入区域软骨下骨100×

讨 论

临床上通常认为软骨内无血液供应，自身愈合能力差，直径超过4 mm的软骨缺损不能完全自我修复，损伤后，会导致关节肿胀和疼痛，影响运动功能，不及时治疗，最终发展为骨性关节炎[5]。为了更好的验证仿生软骨/骨梯度组织工程支架的骨软骨缺损修复能力，本研究选择了以山羊为实验动物，在与人软骨损伤，退变好发部位股骨内侧髁相似的羊股骨内侧髁关节面，利用摆锯制造大尺寸的缺损模型，缺损范围约15 mm×20 mm，深约10 mm，其面积为3 cm2，达到中等面积软骨缺损。其中包含了软骨层，软骨下骨板与软骨下松质骨。钻孔后，骨髓内的软骨源性和骨源性细胞渗透到损伤区，所渗出的血凝块附着到周围正常关节软骨边缘以及支架内，为支架提供自体的干细胞。该复合支架采用仿生设计，包括支架结构和材料性能上的仿生，植入过程未负荷种子细胞。

研究结果显示，大尺寸仿生PEG/PLA/β-TCP复合支架的初步修复效果值得肯定：首先，术后12月，山羊术侧肢体的活动、被动屈伸运动与对侧肢体相似，未出现跛行及行走明显异常。其次，支架植入后，固定良好，植入初期未出现支架脱落、崩解等情况，并能为缺损处组织提供力学支撑。此外，影像学检查发现，支架植入后期，骨软骨缺损缺损处的支架大部分已被吸收降解，并伴随有新生组织的长入。组织学检测显示：术后12月，实验组标本组织学染色示组织标本着色可，新生软骨修复组织完全覆盖缺损区域，但表面不平整，厚度较周围正常软骨薄，部分修复组织可见裂隙、凹陷；修复组织以透明样软骨和纤维软骨混合而成，细胞排列欠规整。实验组有新生的软骨下骨形成，并逐渐向缺损中心相互靠近，有类似于正常软骨下骨的骨板结构形成。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性。骨软骨界面的仿生结构保证了软骨支架稳定的结合与深层软骨细胞的营养供应。β-TCP支架骨支架的弹性模

量与软骨下骨板类似，为表层软骨支架内部的软骨细胞生长、分化，新生软骨组织功能化，提供了有效地应力刺激。随着陶瓷支架的降解，接近于陶瓷面的细胞在应力刺激下向骨方向转化，最终形成了一层微结构类似于软骨下骨板的结构，该结构与新生的软骨组织紧密结合，其结合方式类似于自然骨软骨。软骨的抗压性能与弹性主要由软骨内水分的渗流和软骨基质的形变来承担，这二者均与软骨内占干重百分之60%～70%的胶原显微结构密切相关[6]。近似于自然状态胶原纤维微结构是新生软骨实现功能化的表现之一，也是骨软骨缺损修复，关节功能正常化的保证。软骨下骨组织的重建：软骨下骨的重建与软骨层的修复共同发生，组织学染色示新生修复组织具有类似软骨下骨板结构；V-G染色示陶瓷支架内部及周围有大量胶原的长入，骨小梁作为骨中最重要的结构，其内部就是由大量胶原按照一定方式排列，表面覆盖大量矿物质，所形成的三维网状结构。

但实验研究过程中，仍发现一些问题。首先，PEG吸水膨胀的系数不可控：实验开始前，预先将制造好的干燥的大尺寸PEG/PLA/β-TCP复合支架浸泡在PBS液中，使水凝胶进行充分吸水膨胀。但是，由于水凝胶良好的吸水膨胀特性及其膨胀程度的不可预测性，待取用支架时，发现PEG软骨支架厚度明显增加，因而为了使PEG软骨支架高度与周围正常软骨层高度相当，不得不进行修剪，该修剪的结果可能会影响PEG软骨支架在初期对关节软骨仿生功能的影响。

[1] Filardo G，Perdisa F，Roffi A，etal. Stem cells in articular cartilage regeneration[J]. Journal of Orthopaedic Surgery and Research，2016，11(1):1-15.

[2] 马树强，姬海鹏，王坤正，等.骨-骨膜复合组织与软骨下钻孔治疗关节软骨缺损的实验研究[J].陕西医学杂志，2004，33(5)：390-392.

[3] Sakata R，Iwakura T，Reddi AH. Articular Cartilage Regeneration: Challenges and Opportunities[J].Tissue Engineering Part B Reviews，2015，21(5)：461.

[4] Correa D，Lietman SA. Articular cartilage repair: Current needs，methods and research directions[J]. Seminars in Cell & Developmental Biology，2016，62:67-77.

[5] 朱长宝.软骨微粒复合仿生基质溶胶体外构建组织骨可行性研究[D].重庆：第三军医大学，2015.

[6] Little CJ，Bawolin NK，Chen X.Mechanical properties of natural cartilage and tissue-engineered constructs[J]. Tissue Engineering Part B Reviews，2011，17(4):213.

*国家自然科学基金资助面上项目(81672187)

优秀重点实验室资助项目(51323007)

骨和骨组织 软骨 创伤和损伤 组织工程 支架 山羊

R683

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.008

(收稿：2017-03-03)