头孢他啶在铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠体内的药代动力学研究

于 歆，徐 辉，王诗琪，李晓冰，何晓静，菅凌燕

·药学研究·

头孢他啶在铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠体内的药代动力学研究

于 歆，徐 辉，王诗琪，李晓冰，何晓静，菅凌燕*

目的建立铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)慢性肺部感染大鼠模型，采用高效液相色谱法(High performance liquild chromatography，HPLC)法测定头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)在其体内的药代动力学参数。方法血浆样品经含0.1%甲酸的乙腈沉淀蛋白后，采用ZORBAX SB-C18色谱柱分离，流动相为甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05 % 甲酸) (15∶85，v/v)，流速为1 mL/min，柱温为35 ℃，检测波长为254 nm。结果CAZ在3～150 μg/mL内线性关系良好；方法的日间和日内精密度均小于6.4 %，稳定性良好，Cmax为(47.86±10.40) μg/mL，t1/2为(0.4±0.1) h，AUC0-6为(28.80±10.67) μg·h/mL。CAZ在铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠模型的药动学特征提示，其体内过程符合一级吸收二室模型。结论所建立的HPLC分析方法准确、灵敏、专属性强、重现性高，可用于铜绿假单胞菌慢性肺部感染大鼠体内的头孢他啶药代动力学研究。

头孢他啶；铜绿假单胞菌；药代动力学；HPLC

0 引言

头孢菌素类抗生素具有广谱的抗菌特性和较强的耐酸性，常与氨基糖苷类合用达到良好的杀菌作用[1]。头孢菌素类抗生素根据对β-内酰胺酶稳定性及肾毒性的不同可以分为4类[2]。头孢他啶是第3代头孢菌素类抗生素，对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，PA)具有较强的抗菌作用，对β-内酰胺酶稳定[3]。PA是耐药性较强的致病菌，易导致肺炎/尿路感染等疾病[4]。其产生耐药性的机制主要为β-内酰胺酶的生成和外排泵的表达[5]。对PA有抑制作用的有氨基糖苷类、大环内酯类及β-内酰胺类等[6]。头孢他啶(Ceftazidime，CAZ)是治疗PA感染的一线用药，近年来，国内外学者开展了多项CAZ在大鼠体内的药代动力学研究[7-8]，但并无在PA慢性肺部感染大鼠体内的CAZ药代动力学的研究报道。因此，本研究拟建立PA慢性肺部感染大鼠模型，采用高效液相色谱(HPLC)法，测定PA慢性肺部感染大鼠口服给予CAZ后的经时血药浓度，估算相应的药代动力学参数，评价CAZ在PA慢性肺部感染大鼠的药代动力学特征，为临床用药提供参考。

1 仪器与试药

1.1 药品与试剂 头孢他啶粉针(复达欣，葛兰素史克)；CAZ对照品(中国食品药品检定研究院，批号：130484，含量85.7%)；对乙酰氨基酚(AP)对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100018，含量99%)；甲醇、乙腈(均为色谱纯，美国Fisher公司)；醋酸铵、甲酸(均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；水为去离子水。试剂使用前均经过0.45 μm微孔滤过膜过滤。

1.2 仪器 Agilent1260高效液相色谱仪(含G1311B四元泵，G1329B进样器，G1316A柱温箱，G1314F紫外检测器)；Thermo涡旋混合器；高速离心机(Eppendof Centrifuge5430R)；离心浓缩仪(Thermo Scientific SPD1010/SPD2010)。

1.3 动物 清洁级SD大鼠，雄性，体重150～170 g；合格证号：SCXK[京]2014-0004，由我院医学实验动物中心提供。

1.4 菌株 临床分离PA菌株，由中国医科大学附属盛京医院检验科提供。该PA菌株是对规定药敏试验的抗菌药物均敏感的临床分离株。

2 方法与结果

2.1 PA肺部感染大鼠模型的建立 参照本实验室[9]建立的方法，采用无创气管插管方法接种实验大鼠，建立慢性肺部感染大鼠模型。以大鼠肺匀浆细菌培养出PA细菌及病理学改变检验模型是否成功。

2.2 色谱条件 色谱柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm，Agilent Technologies)；流动相∶甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.05 % 甲酸) (15∶85，v/v)；流速：1 mL/min；柱温：35 ℃；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。

2.3 溶液的制备 分别精密称取CAZ对照品、内标(AP)对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得浓度为1 mg/mL的各储备液。所有储备液置于4 ℃冰箱中保存待用。临用前用纯水精密稀释头孢他啶储备液，制备成30、60、100、300、600、1 000 μg/mL的头孢他啶工作液。

2.4 血浆样本的预处理 精密吸取200 μL大鼠血浆样品，置于1.5 mL的EP管，加入内标对照品溶液20 μL (400 μg/mL)，涡旋30 s。缓慢加入乙腈(含0.1%甲酸) 600 μL，涡旋5 min，静置5 min后，15 600 r/min离心10 min后取上清，移入另1个1.5 mL的EP管中，放入离心浓缩仪中蒸干，将残渣用100 μL流动相复溶，涡旋5 min，于15 600 r/min离心10 min，吸取上清液转移至自动进样器样品瓶中，进行HPLC分析，进样量20 μL。

2.5 方法学验证

2.5.1 专属性研究 CAZ和内标AP色谱峰峰形良好，分离度高，无杂峰干扰测定，基线平稳。本方法选择性好，能准确测定血浆中CAZ的浓度，且灵敏度较高，大鼠血浆中的内源性物质不干扰CAZ和内标AP的测定，CAZ、AP的保留时间分别约为7.8、5.2 min。

2.5.2 线性范围与定量下限 取1.5 mL离心管数支，分别精密加入不同浓度的CAZ对照品溶液20 μL后以氮气流吹干，加入空白血浆200 μL，旋涡混匀，配成含CAZ浓度分别为3、6、10、30、60、100、150 μg/mL的标准含药血浆，按“2.4”项下操作，制备标准曲线，并同时制备空白样品，进行HPLC-UV分析，记录色谱图。以血浆中待测物的浓度为横坐标，待测物与内标的峰面积之比为纵坐标，应用加权最小二乘法(W=1/χ2)，得出标准曲线方程：f=0.010 2 C+0.006 9，r2=0.999 9。结果显示，CAZ在3～150 μg/mL浓度范围内线性关系良好，定量下限均为3 μg/mL。

2.5.3 精密度、准确度及回收率 制备含CAZ浓度分别为5、50、120 μg/mL的标准含药血浆样品，每个浓度平行配制5份，并配制一条标准曲线，按“2.4”项下操作，共配制3个分析批，记录色谱图，计算样品和内标峰面积的比值f，代入当批的标准曲线，求得实测浓度及实测浓度准确度，计算日间、日内精密度及回收率，结果见表1。

表1 大鼠血浆中CAZ的精密度、准确度及回收率(%)

注：RSD为相对标准偏差，RE为相对误差

2.5.4 稳定性试验 配制CAZ低、中、高3种不同浓度(5、50、120 μg/mL)含药血浆适量，每种浓度分取12份，每份200 μL。3份于配制好后按“2.4”项下操作立即分析，并在测定完成后，在进样器样品盘中放置12 h后再次进样分析；3份于室温放置11 h；3份于配制好后反复冻融3次；3份于配制好后放入-20 ℃冰箱中冷冻保存4周后取出解冻，均按“2.4”项下操作分析。由相应的标准曲线方程求出各样品的浓度，计算测得浓度平均值。结果表明，CAZ血浆样品在室温下放置11 h、进样器中放置12 h、反复冻融3次及冰冻放置4周条件下均稳定性良好。

2.5.5 PA慢性肺部感染大鼠CAZ的药代动力学研究 取已造模成功的大鼠6只，禁食12 h，称重后分别尾静脉注射CAZ溶液90 mg/kg，并于给药前及给药后5、15、30、45 min，1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h经大鼠眼底静脉丛取全血0.5 mL。将全血立即置于已预涂肝素的EP管，5 000 r/min，离心10 min。分离上清液，置-20 ℃避光保存待测。PA慢性肺部感染大鼠尾静脉注射给予CAZ溶液90 mg/kg后，CAZ的平均血药浓度-时间曲线见图1。采用DAS 2.0软件计算CAZ的PK参数。达峰浓度(Cmax)和达峰时间(tmax)采用实测值，AUC0～t采用梯形法计算，AUC0～∞按公式AUC0～∞=AUC0～t+Clast/ke计算，Clast为最后一个可测得时间点的血药浓度，ke为表观末端消除速率参数。以半对数作图法，由消除相的4个浓度点计算ke消除半衰期(t1/2)，t1/2=0.693/ke。见表2。

图1 CAZ的平均血药浓度-时间曲线(n=6)

表2 CAZ的药动学参数(n=6)

3 讨论

本实验采用无创气管插管法接种PA藻酸盐包被体建立大鼠PA慢性肺部感染模型，成功率为100%。采用HPLC-UV法测定头孢他啶血药浓度，具有方便快速、准确性高、重现性好等特点。本实验首先建立PA慢性肺部感染模型，研究头孢他啶在此动物模型的药动学特征。本实验采用0.05%甲酸的5 mmol/L醋酸铵缓冲液∶甲醇(85∶15，v/v)为流动相，方法重现性好，峰形良好且头孢他啶与内标对乙酰氨基酚两峰分离度>1.5。与常用磷酸二氢钾[10]作为流动相相比，具有流动相简单且pH值影响小等特点。考察血浆样品处理方法，实验前期采用甲醇作为沉淀剂，提取回收率低。采用乙腈作为沉淀剂，由于乙腈对蛋白的包裹作用，造成样品测定重复性差。经试验，采用含0.1%甲酸的乙腈作为沉淀剂，沉淀效果好，回收率高且重复性好。

本实验首次对铜绿假单胞菌慢性肺部感染模型尾静脉注射头孢他啶后体内的药动学特征进行研究，其体内过程符合一级吸收二室模型，与健康大鼠体内药动学特征[11]无明显差别。

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PharmacokineticsofceftazidimeinratswithchronicpulmonaryinfectioninducedbyPseudomonasaeruginosa

YU Xin,XU Hui,WANG Shi-qi,LI Xiao-bing,HE Xiao-jing,JIAN Ling-yan*

(Department of Pharmacy,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

ObjectiveTo develop an HPLC method for determination of ceftazidime (CAZ) in rats′ plasma samples,and investigate the pharmacokinetic parameters with CAZ in rats with chronic pulmonaryPseudomonasaeruginosa(PA) infection.MethodsThe plasma samples were precipitated by acetonitrile,which contained 0.05% formic acid,and then it was separated on a 35 ℃ ZORBAX SB-C18column with a mobile phase of methanol and 5 mmol/L ammonium acetate buffer solution containing 0.05% formic acid (15∶85,v/v),at a flow rate of 1 mL/min.The detection wavelength was 254 nm.ResultsThe method exhibited good linearity within the concentration range of 3～150 μg/mL.The values on both occasions (intra- and inter-day) were all within 6.4%,and CAZ was stable in rat plasma under different storage conditions.The Cmaxwas (47.86±10.40) μg/mL,thet1/2was (0.4±0.1) h,and the AUC0-6was (28.80±10.67) μg·h/mL.The pharmacokinetic characteristics of CAZ in PA chronic pulmonary infectious model of rats showed that they were in line with the two-compartment model with first order absorption.ConclusionThe developed HPLC method is accurate,sensitive and reproducible,it is suitable for the pharmacokinetic study of CAZ in the PA chronic pulmonary infected rat.

Ceftazidime;Pseudomonasaeruginosa;Pharmacokinetics;HPLC

2016-12-10

中国医科大学附属盛京医院药学部，沈阳 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201710020