清热解毒片特征图谱的研究

2017-11-01

山西卫生健康职业学院学报 2017年5期

关键词：奎宁酰基连翘

(山西省食品药品检验所，山西太原 030001)

·基础医学·

清热解毒片特征图谱的研究

连云岚，郝云芳，杜娟，冯贞

(山西省食品药品检验所，山西太原 030001)

目的建立清热解毒片特征图谱，为评价清热解毒片整体质量提供依据。方法方法采用HPLC法，对清热解毒片建立了特征图谱，色谱柱采用自装C18柱(日本富士填料；5μm，4.6 mm×250 mm)，流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱，检测波长276 nm。结果共指认出17个共有峰，包括处方中6味药材。结论所建立的特征图谱能反映清热解毒片整体质量状况。

清热解毒片；特征图谱；HPLC

中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的手段，得到的能够标示该中药特征的共有峰的图谱，是一种综合的、可量化的鉴别手段，是当前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制模式之一[1]。

清热解毒片由生石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、甜地丁、黄芩、龙胆、板蓝根、知母、麦冬等12味药材组成，主要功效为清热解毒，用于热毒壅盛所致的发热面赤，烦躁口渴，咽喉肿痛；流感、上呼吸道感染见上述证候者[2]。本实验通过建立清热解毒片的特征图谱，旨在评价不同企业的产品质量，尽量保证清热解毒片从原料到工艺过程控制最终到制剂的均一稳定

1 仪器与试药

仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，DAD 检测器。

对照品：绿原酸(110753-201415，96.2%)、栀子苷(110749-201115，99.7%)、芒果苷(111607-200402，100%)、黄芩苷(110715-201318，93.3%)、连翘苷(110821-200406，100%)、哈巴俄苷(111730-200604，100%)、汉黄芩苷(112002-201501，98.8%)、黄芩素(111595-200604，100%)、汉黄芩素(1514-200001，100%)，均购于中国食品药品检定研究院。

隐绿原酸(成都曼斯特；MUST-15011413；99.07%)，3、4-二咖啡酰基奎宁酸(成都曼斯特；MUST-14111411；99.05%)，3、5-二咖啡酰基奎宁酸(成都曼斯特；MUST-14071507；98.82%)，4、5-二咖啡酰基奎宁酸(成都曼斯特；MUST-14111414；99.84%)。

试药：乙腈为色谱纯；水为一级纯化水；其他试剂均为分析纯。

处方中12味药材均由某药业有限公司提供。

样品：来源于2016年国家计划抽验品种

2 方法与结果

2.1 色谱条件的考察

2.1.1 色谱柱的选择试验过程中选择以下3种不同的色谱柱：a)Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm)；b)自装柱日本富士填料 C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；c)Agilent ZORBAX SB-phenyl柱(5μm，4.6 mm×250 mm)。柱温： 30℃，流速：1.0 mL/min。

比较结果，在自装柱HPLC图谱中有多个色谱峰且分离效果较好。综合考虑，选用自装柱作为指纹图谱的色谱柱。

2.1.2 流动相的选择根据文献[3]，采用乙腈-0.4%磷酸梯度洗脱系统。见表1。

表1 流动相

实验结果表明，采用以上色谱柱及流动相系统，谱图上各个色谱峰的分离度较好，保留时间适中，故选此流动相系统作为清热解毒片的HPLC指纹图谱检测的流动相系统。

2.1.3 检测波长的选择实验过程中采用200～400 nm的DAD检测器进行扫描检测。通过调整波长观察色谱图发现，在276 nm波长下的HPLC图谱中色谱峰最多，且分离效果最好，故选定276 nm作为指纹图谱的测定波长。

2.2 供试品溶液的制备

因清热解毒片(胶囊)方中药材有效成分多为苷类，查阅相关经文献[3]，苷类提取多采用不同浓度的甲醇或乙醇超声提取，故采用正交设计助手(3.1版)对样品的提取进行三因素(提取溶剂、提取时间和溶剂量)三水平(50%甲醇、70%甲醇、甲醇；30、40、60 min；15、20、25倍)正交试验设计[4，5]，以黄芩苷峰面积为指标，正交设计结果见表2～5。

表2 正交试验计划表

表3 直观分析表

表4 方差分析表

表5 交互作用表

从方差分析表看出，提取溶剂对试验结果有明显影响，结合直观分析和交互分析可以得出结论，采用A2B1C2条件下提取效率最高，即70%甲醇20 mL，提取30 min。

另外比较了70%甲醇和70%乙醇提取溶剂对结果的影响，结果无明显差异，故从环保角度考虑，最终确定供试品制备条件为：取清热解毒片适量，除去包衣，研细，精密称定0.5 g，精密加入70%乙醇20 mL，称定重量，超声处理30 min(功率250W，频率33KHz)，放冷，补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用微孔滤膜滤过，即得。

2.3 特征图谱建立

共有峰的指认：a)样品测定分别采用色谱峰数目多且相对稳定的某药业有限公司的清热解毒片共有色谱峰为特征峰建立对照特征图谱。b)对照药材的归属将清热解毒片处方中除生石膏外的其余11味药材，依清热解毒片制法处理，并按照2.2供试品溶液的制备项下方法制备对照药材溶液，进样药材归属分析，结果11味药材中有六味药材出现了特征峰，分别为金银花、栀子、知母、黄芩、连翘、玄参，其中金银花、黄芩有几类群峰。c)对照品的归属为进一步验证各峰的归属，将金银花、栀子、知母、黄芩、连翘、玄参中已知化学成分(现有药典收载的)的相应对照品，如绿原酸、隐绿原酸、3,4-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-二咖啡酰基奎宁酸、栀子苷、芒果苷、黄芩苷、汉黄芩苷、连翘苷、哈巴俄苷等，进样分析，结果如下：连翘苷的保留时间为67.612，是连翘的特征峰；黄芩有4个峰，分别为黄芩苷(65.584)、汉黄芩苷(77.487)、黄芩素(88.136)、汉黄芩素(106.747)，其余为黄芩中的未知成分；金银花有5个峰，分别为绿原酸(27.169)、隐绿原酸( 28.724)、3,4-二咖啡酰基奎宁酸(52.986)、3,5-二咖啡酰基奎宁酸(54.846)、4,5-二咖啡酰基奎宁酸(58.775)，其余为金银花中的未知成分；芒果苷的保留时间为34.514 ，是知母的特征峰；哈巴俄苷的保留时间为74.218，是玄参的特征峰；31.409为栀子苷和龙胆苦苷的共有峰。d)清热解毒片指纹图谱对照图谱的建立由上述分析，可知对照指纹图谱共出现17个特征峰，以黄芩苷作为参照峰(S峰)计算各峰相对保留时间，并按照规定其相对保留时间应在规定值的±5%之内确定，分别归属到金银花、黄芩、连翘、玄参、栀子、龙胆6味药材，其中能够指认到不同药材17个峰的相对保留时间规定值分别为0.41(峰1)、0.44(峰2)、0.48(峰3)、0.68(峰4)、0.72(峰5)、0.76(峰6)、0.81(峰7)、0.84(峰8)、0.90(峰9)、1.00(峰S)、1.03(峰10)、1.08(峰11)、1.10(峰12)、1.13(峰13)、1.18(峰14)、1.34(峰15)、1.63(峰16)。

综上，建立的清热解毒片对照特征图谱及其各峰归属的指认如下(见图1、表6)：

图1 清热解毒片对照特征图谱

序号相对保留时间色谱峰指认归属序号相对保留时间色谱峰指认归属10．41绿原酸金银花90．94，5-二咖啡酰基奎宁酸金银花20．44隐绿原酸金银花101黄芩苷黄芩30．48栀子苷、龙胆苦苷栀子、龙胆111．03连翘苷连翘121．08未知黄芩、甜地丁40．68未知连翘、黄芩131．1哈巴俄苷玄参50．72未知金银花、黄芩141．13未知连翘、黄芩60．76未知金银花、黄芩151．18汉黄芩苷黄芩161．34黄芩素黄芩70．813，4-二咖啡酰基奎宁酸3，5-二咖啡酰基奎宁酸金银花171．63汉黄芩素黄芩80．84金银花

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度试验取同一供试品(某药业有限公司，批号：1509004)溶液，按“2.2”项下色谱条件，连续进样6次，结果各共有峰的相对保留时间RSD为0～0.86%，相对峰面积的RSD为0～3.36%，表明仪器系统精密度良好。

2.4.2 稳定性试验取同一供试品(某药业有限公司，批号：1509004)溶液，按“2.2”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、16和24 h进行指纹图谱测定，结果显示，各共有峰相对保留时间(RRT)的RSD均小于3%，相对峰面积(RPA)的RSD均小于4%。表明供试品溶液至少在24 h内稳定，稳定性良好，符合指纹图谱要求。

2.4.3 重复性试验取同一供试品(某药业有限公司，批号：1509004)溶液，按“2.2”项下方法分别制备供试品溶液6份，按“2.2”项下色谱条件测定指纹图谱，结果显示，各共有峰的相对保留时间RSD均小于 1%，相对峰面积RSD均小于4%。表明供试品溶液重现性良好，符合指纹图谱要求。

2.4.4 耐用性试验采用Agilent1260高效液相色谱仪，岛津LC-20AT高效液相色谱仪；不同色谱柱：a)Agilent ZORBAX SB-C18柱(5μm，4.6 mm×250 mm)；b)自装柱富士填料 C18(5μm，4.6 mm×250 mm)；c)迪马Inertsil C8-3(5μm，4.6 mm×250 mm)；自装柱富士C18(5μm,4.6 mm×250 mm)，均能达到良好的分离效果。