NMDA受体介导戊二酸尿症I型纹状体神经元损伤

高金枝 张 偲 易 琴 应艳琴 罗小平

华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科（湖北武汉 430030）

NMDA受体介导戊二酸尿症I型纹状体神经元损伤

高金枝 张 偲 易 琴 应艳琴 罗小平

华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科（湖北武汉 430030）

目的探讨NMDA受体在戊二酸尿症I型纹状体神经元兴奋性损伤中的作用。方法利用构建的特异性沉默戊二酰辅酶A脱氢酶（GCDH）慢病毒载体感染原代培养纹状体神经元结合高浓度赖氨酸培养构建GA1细胞模型。Western-Blot检测NMDA受体蛋白表达水平变化。NMDA受体拮抗剂MK-801预处理神经元，再行慢病毒及高浓度赖氨酸干预，MTT检测神经元活性及Hoechst3342检测神经元凋亡情况。结果与对照组比较，实验组的NR2B蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.001）。实验组、对照组以及MK-801预处理组三组间神经元活性和正常核比例的差异均有统计学意义（P＜0.01）；两两比较发现，实验组神经元活性和正常核比例较对照组明显下降，MK-801预处理后神经元活性和正常核比例较实验组明显升高，但仍低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论NR2B受体介导戊二酸尿症I型体内代谢累积物致纹状体神经元损伤。

戊二酸尿症I型； 纹状体； 神经元； 兴奋性损伤； NMDA受体

戊二酸尿症Ⅰ型（glutaric aciduria type Ⅰ，GA1）是一种常染色体隐性遗传疾病，该病各种族发生率不同，台湾地区统计约1/106 474，浙江省统计约1/64 708[1-3]。患儿常在生后3～36个月因感染、腹泻等非特异性疾病诱发急性脑病危象，随即出现以纹状体损伤为主的神经系统后遗症甚至死亡。目前已知该病是因患儿体内戊二酰辅酶A脱氢酶（glutaryl-CoA dehydrogenase，GCDH）缺陷引起的赖氨酸、色氨酸等有机酸代谢障碍。戊二酸（glutaric acid，GA）、3-羟基戊二酸（3-hydroxyglutaric acid，3-HGA）等代谢产物在体内蓄积选择性地损伤神经系统，致纹状体神经元退行性变，广泛白质变性，胶质增生[4]。

尽管具体脑损伤机制尚未明确，大量体内外实验均提示GA、3-HGA等代谢产物的神经毒性主要表现在兴奋性损伤、氧化损伤及细胞能量代谢损伤三个方面[5]。其中兴奋性损伤的研究中，NMDA受体（N-methyl-D-aspartate receptors）的研究较多。NMDA受体是脑内最重要的兴奋性神经递质谷氨酸突触后膜的受体，其可能介导GA、3-HGA所致的神经元兴奋性损伤[6]。研究已证实采用携带靶向沉默GCDH基因shRNA的慢病毒载体感染原代纹状体神经元，GCDH蛋白表达下降达80.78%，结合高浓度赖氨酸培养成功构建了GA1细胞模型[7]。本研究利用该细胞模型检测神经元NMDA受体表达变化，及NMDA受体拮抗剂MK-801对GA1细胞模型神经元损伤是否有保护性作用；进一步证实NMDA受体在GA1神经元兴奋性损伤中的作用。

1 材料与方法

1.1 GA1细胞模型建立

出生24 h内的清洁级Sprague-Dawley大鼠乳鼠由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。胰酶消化配合无血清培养基培养高纯度的原代纹状体神经元[7]。神经元分为阴性对照组、实验组和MK-801预处理组。原代神经元培养7天后，分别用携带靶向沉默GCDH基因shRNA的慢病毒载体（实验组）和阴性对照组病毒（对照组）感染神经元。感染后细胞继续培养72 h 换含5 mmol/L赖氨酸的高浓度赖氨酸培养基继续培养。MK-801预处理组为原代纹状体神经元培养6天后培养基中加入10 μmol/L MK-801，继续细胞培养24 h 用携带靶向沉默GCDH基因shRNA的慢病毒载体感染神经元，病毒感染72 h 换含5 mmol/L赖氨酸和10 μmol/L MK-801培养基继续培养。细胞培养用胎牛血清、马血清、Neurobasal培养基、B27购于Gibco公司。谷氨酰胺、DMEM高糖培养基购于Hyclone公司。胰蛋白酶、多聚赖氨酸购于Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 神经元NMDA受体蛋白表达检测 采用Western blot方法。换高浓度赖氨酸培养基培养24 h，弃培养基，磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞2次，加细胞裂解液收集细胞至EP管中，50 w超声仪震荡10 s，冰上静置10 min，重复3次。予SDS-PAGE 电泳（浓缩胶75 V和分离胶120 V恒压电泳）；200 mA，转膜45 min至聚偏氟乙烯膜（PVDF）上；转膜后4 ℃一抗（NR1以1∶500稀释、NR2A以1∶3 000稀释、NR2B以1∶ 2 000稀释）孵育过夜，二抗（1∶3 000稀释）孵育1 h，增强化学发光法（ECL）显色。UVP Labworks照相、Labworks 4.6软件定量分析光密度值（OD值）。检测结果以NR1、NR2A、NR2B与β-actin的OD值比值确定NR1、NR2A、NR2B蛋白表达的相对水平。β-actin兔抗鼠单克隆抗体、羊抗鼠NR1、NR2A、NR2B多克隆抗体购于Santa Cruz。辣根过氧化物酶标记羊抗兔及兔抗山羊二抗购于KPL。

1.2.2 MTT检测各组神经元活性 换高浓度赖氨酸培养基培养24 h后，每孔细胞在0.5 mg/mL MTT，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h，换DMSO室温摇床震荡15 min。570 nm测量波长，630 nm参照波长测定各孔的光密度值（OD值）。无细胞培养孔加培养液做空白对照。MTT购于Amresco。

1.2.3 Hoechst 33342检测各组神经元凋亡 换高浓度赖氨酸培养基培养24 h后，避光37 ℃，10 μg/mL Hoechst 33342孵育细胞10 min。4%多聚甲醛，避光固定细胞10 min。PBS洗涤细胞后荧光显微镜下观察。每孔至少拍摄10个视野，计算Hoechst 33342染色阳性核比例。Hoechst 33342购于Sigma公司。

1.3 统计学分析

运用SPSS 17.0软件包行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 原代纹状体神经元培养及慢病毒感染

细胞培养7 天后，镜下神经元突起细长交织成网状，胞体折光性好，可见胞核，部分神经元呈聚集状态（图1）。慢病毒以感染复数（MOI）=10感染神经元，免疫荧光显微镜下可见超过90%的细胞显示绿色荧光，胞体透亮、立体且有光晕，突起细长交织成网状（图1）。

图1 镜下纹状体神经元及慢病毒感染（×100）

2.2 NMDA受体表达变化

实验组NR2B表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.001）。两组间NR1、NR2A的表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表1。

2.3 MTT检测MK-801预处理对神经元活性的影响

图2 NMDA受体蛋白表达变化

表1 NMDA受体蛋白相对表达量比较

实验组、对照组以及MK-801预处理组三组间神经元活性的差异有统计学意义（F=17.65，P=0.003）。两两比较发现，实验组较对照组细胞活性明显下降，MK-801预处理后细胞活性较实验组明显升高，但与对照组比较细胞活性仍明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 MTT检测各组间神经元OD值比较

2.4 Hoechst 33342检测MK-801预处理对神经元凋亡的影响

正常神经元椭圆形胞核被均染成淡蓝色；凋亡神经元胞核出现局部深染高密度区，部分胞核呈月牙形甚至可见胞核碎片。实验组、对照组以及MK-801预处理组三组间神经元正常核比例的差异有统计学意义（F=240.01，P＜0.001）；实验组神经元正常核比例明显低于对照组，MK-801预处理后神经元正常核比例较实验组明显上升，但与对照组比较神经元正常核比例仍明显下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见图3、表3。

3 讨论

图3 各处理组细胞Hoechest33342染色（×100）

表3 Hoechest33342染色各组间神经元正常核比例

GA1是一种常染色体隐性遗传疾病，编码GCDH的基因发生突变致GCDH缺陷。GCDH是赖氨酸、色氨酸等有机酸代谢的关键酶。GCDH缺陷致GA、3-HGA等代谢产物在体内蓄积选择性地不可逆性损伤纹状体为主的神经系统。较多国家已将该病纳入新生儿疾病筛查范畴。虽然早期的诊断和严格依从指南的治疗可明显改善患儿预后，仍有部分患儿遗留神经系统后遗症[8]。GA1发病机制亟待进一步研究。近年来，大量研究结果显示GA、3-HGA等代谢产物的神经毒性主要集中在兴奋性损伤、氧化损伤及细胞能量代谢损伤三个方面[5]。

GA、3-HGA结构上与谷氨酸相似。谷氨酸是脑内最重要的兴奋性神经递质，与认知、记忆、运动等多项功能有关。谷氨酸膜受体过度刺激致大量的Ca2+和Na+内流活化蛋白酶、磷酸酶等最终致神经元死亡，这个过程被称为兴奋性损伤。GA1患者尸检结果发现基底节及大脑皮质均显示突触后空泡形成，这与谷氨酸介导的脑损伤特征一致。GCDH基因敲除鼠脑组织实验也证实GA扰乱谷氨酸平衡致神经元兴奋性损伤[9]。甚至高浓度GA可直接通过NMDA受体致纹状体神经元兴奋性损伤[6]。但也有研究显示3-HGA不能直接影响神经元活性，还提出兴奋性损伤可能由色氨酸旁路代谢途径生成的喹啉酸通过NMDA受体介导[10]。兴奋性损伤机制尚不明确。

NMDA受体是一种重要的谷氨酸门控通道，参与多种神经发育与功能活动过程。该受体有多个亚单位NR1、NR2A、NR2B、NR2C、NR2D、NR3A、NR3B等。每个受体是由2～3个亚单位组成的异聚体，且至少含有1个NR1亚单位。受体异聚体含有不同的NR2亚单位则其介导不同的功能活动[11]。对PC12细胞系和原代培养皮质神经元细胞的兴奋性损伤研究发现该损伤主要由NR2B介导[12]。同时对GCDH基因敲除鼠（GCDH-/-小鼠）的研究发现其纹状体NR2A、NR2B含量明显增加[13]。还有对高赖氨酸饮食饲养GCDH-/-小鼠的研究提出其纹状体NMDA受体NR2B明显增加可能是其神经元兴奋性损伤易感性的原因[14]。

本研究用靶向沉默GCDH基因的慢病毒载体感染原代纹状体神经元结合高浓度赖氨酸培养模拟GA1赖氨酸代谢产物蓄积对纹状体神经元的影响。细胞模型中NR2B蛋白量较对照组显著性升高，NR1、NR2A蛋白量无明显变化，且两组中NR2A含量都极低。MK-801是一种高选择性的NMDA受体阻断剂，对NR1和NR2A/ NR2B异聚体受体（NR1/NR2A或NR1/ NR2B）有特异性阻断作用。本实验中MK-801预处理可有效阻断赖氨酸代谢产物蓄积所致的纹状体神经元损伤。由此推测GA1代谢产物致纹状体神经元兴奋性损伤主要由NR2B介导。

[1]Govender R, Mitha A, Mubaiwa L.A review of patients with glutaric aciduria type 1 at Inkosi Albert Luthuli Central Hospital, Durban, South Africa [J].S Afr Med J, 2017,107(3): 201-204.

[2]Tsai FC, Lee HJ, Wang AG, et al.Experiences during newborn screening for glutaric aciduria type 1: diagnosis,treatment, genotype, phenotype, and outcomes [J].J Chin Med Assoc, 2017, 80(4): 253-261.

[3]Yang L, Yin H, Yang R, et al.Diagnosis, treatment and outcome of glutaric aciduria type I in Zhejiang Province,China [J].Med Sci Monit, 2011, 17(7): 55-59.

[4]Harting I, Boy N, Heringer J, et al.1H-MRS in glutaric aciduria type 1: impact of biochemical phenotype and age on the cerebral accumulation of neurotoxic metabolites [J].J Inherit Metab Dis, 2015, 38(5): 829-838.

[5]Jafari P, Braissant O, Bonafé L, et al.The unsolved puzzle of neuropathogenesis in glutaric aciduria type I [J].Mol Genet Metab, 2011, 104(4): 425-437.

[6]Tian F, Fu X, Gao J, et al.Glutaric acid-mediated apoptosis in primary striatal neurons [J].Biomed Res Int, 2014, 2014:484731.

[7]Gao J, Zhang C, Fu X, et al.Effects of targeted suppression of glutaryl-CoA dehydrogenase by lentivirus-mediated shRNA and excessive intake of lysine on apoptosis in rat striatal neurons [J].PLoS One, 2013, 8(5): e63084.

[8]Boy N, Mühlhausen C, Maier EM, et al.Proposed recommendations for diagnosing and managing individuals with glutaric aciduria type I: second revision [J].J Inherit Metab Dis, 2017, 40(1): 75-101.

[9]Busanello EN, Fernandes CG, Martell RV, et al.Disturbance of the glutamatergic system by glutaric acid in striatum and cerebral cortex of glutaryl-CoA dehydrogenase-deficient knockout mice: possible implications for the neuropathology of glutaric acidemia type I [J].J Neurol Sci, 2014, 346(1-2):260-267.

[10]Colín-González AL, Paz-Loyola AL, Serratos I, et al.Toxic synergism between quinolinic acid and organic acids accumulating in glutaric acidemia type I and in disorders of propionate metabolism in rat brain synaptosomes: relevance for metabolic acidemias [J].Neuroscience, 2015, 308:64-74.

[11]Iacobucci GJ, Popescu GK.NMDA receptors: linking physiological output to biophysical operation [J].Nat Rev Neurosci, 2017, 18(4): 236-249.

[12]Wu Y, Chen C, Yang Q, et al.Endocytosis of GluN2B-containing NMDA receptors mediates NMDA-induced excitotoxicity [J].Mol Pain, 2017, 13∶1744806917701921.

[13]Lagranha VL, Matte U, de Carvalho TG, et al.Increased glutamate receptor and transporter expression in the cerebral cortex and striatum of gcdh-/- mice∶ possible implications for the neuropathology of glutaric acidemia type I [J].PLoS One, 2014,9(3)∶ e90477.

[14]Rodrigues MD, Seminotti B, Amaral AU, et al.Experimental evidence that overexpression of NR2B glutamate receptor subunit is associated with brain vacuolation in adult glutaryl-CoA dehydrogenase deficient mice∶ a potential role for glutamatergicinduced excitotoxicity in GA I neuropathology [J].J Neurol Sci,2015, 359(1-2)∶ 133-140.

Damage of striatal neurons mediated by NMDA receptors in glutaric aciduria type Ⅰ

GAO Jinzhi, ZHANG Cai, YI Qin, YING Yanqin, LUO Xiaoping
(Department of Pediatrics, Tongji Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, Hubei, China)

ObjectiveTo explore the excitotoxic role of NMDA receptors in striatal neurons in glutaric aciduria type I(GA1).MethodsA GA1 cell model was established by lentivirus-mediated shRNA to GCDH and excessive intake of lysine.The expression levels of NMDA receptors were determined by Western blotting.The striatal neurons were preprocessed by MK801(a NMDA receptor antagonist), then infected with lentivirus and cultured in high concentration lysine.Cell viability was measured using MTT.Apoptosis was assessed using Hoechst33342 staining.ResultsCompared with the control group,the expression of NR2B protein in the experimental group was increased, and there was statistical difference (P＜0.001).The differentces in the cell viability and normal nuclear proportion among experimental group, control group, and MK-801 pretreatment group were statistically significant (P＜0.01).The cell viability and normal nucleus proportion in experimental group were significantly lower than those in control group while they were significantly higher in MK-801 pretreated group than those in the experiment group but still significantly lower than those in control group (Pall ＜0.05).ConclusionThe accumulation of metabolites in GA 1 played a toxic role in striatal neurons through NMDR receptors.

glutaric aciduria type I; striatum; neuron; excitability injury; NMDA receptor

doi∶10.3969/j.issn.1000-3606.2017.10.015

罗小平 电子信箱：xpluo@tjh.tjmu.edu.cn

2017-04-11）

（本文编辑：邹 强）