一株产木聚糖酶菌株的筛选及发酵产酶条件优化

张庆芳，许 晶，杨旭立，郭赛赛

(1.兰州理工大学能源与动力工程学院，甘肃 兰州 730050；2.兰州理工大学石油化工学院，甘肃 兰州 730050)

一株产木聚糖酶菌株的筛选及发酵产酶条件优化

张庆芳1，2，许 晶2，杨旭立2，郭赛赛2

(1.兰州理工大学能源与动力工程学院，甘肃 兰州 730050；2.兰州理工大学石油化工学院，甘肃 兰州 730050)

以木聚糖为唯一碳源，从含有大量腐烂枯枝树叶土壤中筛选到一株高产木聚糖酶菌株，经形态学分析和分子学鉴定，确定其为链霉属(Streptomyces)。通过单因素实验考察了碳源、氮源、初始pH值、发酵温度和发酵时间对酶活的影响；在单因素实验的基础上，利用Design-Expert软件对碳源、氮源和发酵时间进行响应面分析。单因素实验确定适宜发酵产酶条件为：复合碳源为玉米芯粉+蔗糖(1∶2)、氮源为硝酸铵、初始pH值4.0、发酵时间2.5 d、发酵温度30 ℃，此时，所产木聚糖酶酶活为511 U·mL-1；响应面分析确定最优发酵产酶条件为：复合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量4.09%、氮源硝酸铵添加量1.16%、初始pH值4.0、发酵时间3.14 d、发酵温度30 ℃，此时，所产木聚糖酶酶活达到641 U·mL-1,较单因素实验提高了25.44%。

半纤维素酶；木聚糖酶；发酵；响应面分析

我国是农业大国，每年都会产生大量可回收利用的农业废弃物，其中大部分为农作物秸秆，据统计我国每年农作物秸秆产量在6亿t左右，其中玉米秸秆总产量达到2.2亿t。秸秆中含有大量的生物质资源，如何合理高效利用秸秆中的生物质已引起世界各国的普遍关注，并逐渐成为农业可持续发展过程中至关重要的因素[1]。半纤维素约占木质纤维素物质的32%，仅次于纤维素(35%)。因此如何低成本、高效利用半纤维素类物质对充分利用我国大量秸秆资源具有重要意义[2]。

半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体,这些糖是五碳糖和六碳糖，包括戊糖(D-木糖、L-阿拉伯糖)、己糖(D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖)和糖醛酸(D-葡萄糖醛酸)等[3]。早期对半纤维素的研究主要集中在通过物理或化学的方法将其转化成小分子的糖类、化学品、燃料和能量，主要方法包括：过氧化氢抽提法、碱液抽提法、热处理法和机械处理法，但这些方法对设备要求较高、对环境影响较大，很难得到进一步的发展[4]；现阶段，主要采用生物方法来处理半纤维素，利用高产半纤维素酶的微生物将半纤维素分解成小分子物质，生物方法比较温和，对设备要求不高，对环境影响较小。半纤维素酶是一个复杂的酶系，很多半纤维素酶是以木糖为主链，侧链有甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖等单糖，分解半纤维素的有木聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露聚糖酶等。产木聚糖酶的微生物种类众多，在陆地和海洋中都普遍存在[5]，主要包括好氧和厌氧细菌、丝状真菌、放线菌、酵母菌、藻类和古菌等，现阶段研究的产木聚糖酶微生物主要是丝状真菌类[6-7]。

发酵条件的不断优化是提高产酶量和酶活的重要方法之一。优化的发酵条件主要通过单因素实验和正交实验得到，但都无法得到整个区域上各个因素之间的最佳组合和响应值的最优值[8-9]。而Design-Expert软件可以快速、可靠、简易地进行实验设计和数据分析。

课题组前期筛选出高产纤维素酶的菌株[9]，在此以木聚糖为唯一碳源，从含有大量腐烂枯枝树叶的土壤中筛选高产木聚糖酶菌株，并在单因素实验的基础上，利用Design-Expert对发酵产酶条件进行优化，以期最大程度地提高菌株产酶能力[10]，为秸秆的资源化利用提供帮助。

1 实验

1.1 土样、试剂与仪器

土样，取自含有大量腐烂枯枝树叶的土壤。

木聚糖(纯度≥85%)、D-木糖、乳酸酚棉蓝染色液。

恒温气浴振荡器、超净工作台、紫外分光光度计、pH计、灭菌锅。

1.2 培养基

初筛培养基：(NH4)2SO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g,NaCl 0.5 g，木聚糖 2 g,琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

查氏培养基：NaNO33 g，K2HPO41 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g，KCl 0.5 g，蔗糖 30 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1 000 mL。

种子培养基：葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，酵母粉5 g，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

产酶培养基：(NH4)2SO45 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，酵母粉 5 g，木聚糖5 g，蒸馏水1 000 mL。

液体发酵培养基：250 mL三角瓶中装2 g碳源，加100 mL无机盐溶液，NH4NO30.5%。

1.3 木聚糖酶产生菌的筛选

1.3.1 富集

称取土样5 g，加100 mL无菌水，于30 ℃、170 r·min-1恒温摇床富集培养10～12 h。

1.3.2 分离纯化

取出菌液，静置30 min，吸取上清液进行10倍梯度稀释；分别吸取10～105梯度浓度菌液各0.1 mL均匀涂布到初筛培养基上，每个稀释度做2个重复，于30 ℃恒温培养若干天；根据透明圈的大小挑选菌株接种于查氏培养基上，30 ℃恒温培养5 d；再挑取单菌落于查氏培养基上，如此反复，直到培养菌株被纯化为止。

1.3.3 种子培养液的制备

挑取一环纯化菌株接种到50 mL(100 mL三角瓶)种子培养基中，于30 ℃、170 r·min-1恒温振荡培养48 h，即得种子培养液。

1.3.4 发酵液的制备

吸取10 mL种子培养液至100 mL(250 mL三角瓶)产酶培养基中，于30 ℃、170 r·min-1恒温振荡培养5 d，即得发酵液。测定发酵液中木聚糖酶的酶活，做3个平行，取平均值。

1.3.5 保存

PDA培养基短期保存：每批样取2个菌落，接种到PDA斜面培养基上，于30 ℃、170 r·min-1摇床振荡培养，待长出明显菌落后放入4 ℃冰箱中短期保存。

甘油低温(-71 ℃)长期保存：每批样取2个菌落，接种到8 mL LB种子培养基中，于30 ℃、170 r·min-1摇床扩大培养，待长出明显菌落后加入2 mL灭菌甘油，在振荡器中摇匀，将摇匀的菌体移至2 mL保菌管中，放入保菌盒，于-71 ℃下保存。

1.4 木聚糖酶产生菌的鉴定

有一天，颖春开着一辆车来到了野猪坳，她是带女儿来看我的。秀红非常热情地接待了她和女儿，又是杀土鸡又是煮野菜的。吃饭的时候，女儿高兴地对我说，爸爸，告诉你一个好消息，妈妈当官了，是你原来的那个位置，县农业局副局长。

利用真菌ITS两端的保守引物PCR扩增未知菌株的ITS片段，进行DNA测序，与NCBI GenBank中的已知序列进行同源性比对后，判断木聚糖酶产生菌的种类，并划分到属或种。

1.5 木聚糖酶的酶活测定

采用DNS法测定木聚糖酶的酶活：吸取适当稀释的发酵液0.5 mL，加到1.5 mL用pH值为4.8的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制的1%木聚糖溶液中，50 ℃酶解30 min；加入3 mL DNS试剂，沸水浴中加热5 min；用冰水迅速冷却，补加蒸馏水至25 mL，测定540 nm处吸光度。以高压锅灭活的发酵液作对照。

酶活力单位定义：在50 ℃、pH值 5.0的条件下，水解木聚糖底物1 min所产生的酶量为一个酶活力单位(U)[11]。

式中：W为酶解反应生成的木糖量，可从木糖标准曲线查得，mg；N为发酵液的稀释倍数；30为酶解时间，min；V为反应液体积，mL。

1.6 木聚糖酶产生菌发酵产酶条件优化

首先研究了碳源、氮源、初始pH值、发酵时间和发酵温度对菌株发酵产酶的影响，确定几个主要影响因素；再利用Design-Expert软件对碳源、氮源和发酵时间进行实验设计和数据分析，得到最佳发酵产酶条件[12]。

2 结果与讨论

根据透明圈的大小挑选若干菌株，接种于查氏培养基中，反复接种多次，得到纯化的菌株；经种子培养基扩大培养，再接种到发酵培养基中；取发酵液的上清液，测定酶活，得到一株酶活力较高的菌株。

上海生工生物公司对该菌株进行分子学鉴定，确定其为链霉属(Streptomyces)，主要包括海洋白浅灰链霉菌、绿色产色链霉菌、灰略红链霉菌、暗黑微绿链霉菌、潮湿链霉菌和大孢子链霉菌，含量达到99%。

2.2 产酶条件的单因素优化

2.2.1 碳源

保持液体发酵培养基其它成分不变，分别以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、玉米芯粉、小麦秆粉、玉米秆粉、甘蔗渣作为唯一碳源，于30 ℃、170 r·min-1发酵3 d，测定酶活，考察不同碳源对酶活的影响，结果见图1。

图1 不同碳源对酶活的影响Fig.1 Effect of different carbon sources on enzyme activity

从图1可以看出,蔗糖和玉米芯粉作为唯一碳源时，酶活较高，分别为324 U·mL-1和321 U·mL-1。

在此基础上，以玉米芯粉+蔗糖作为复合碳源，考察其对酶活的影响，结果见图2。

图2 复合碳源对酶活的影响Fig.2 Effect of composite carbon sources on enzyme activity

从图2可以看出，复合碳源玉米芯粉+蔗糖的最佳比例为1∶2，此时，酶活可达365 U·mL-1。

2.2.2 氮源

保持液体发酵培养基其它成分不变，分别以无机氮源氯化铵、硝酸铵和有机氮源蛋白胨、酵母粉作为唯一氮源，于30 ℃、170 r·min-1发酵3 d，测定酶活，考察不同氮源对酶活的影响，结果见图3。

从图3可以看出，以硝酸铵作为唯一氮源时，酶活最高，为416 U·mL-1。

2.2.3 初始pH值

用0.1 mol·L-1柠檬酸和氢氧化钠溶液调节无机盐溶液的初始pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以最佳碳源和氮源配制液体发酵培养基，于30 ℃、170r·min-1发酵3 d，测定酶活，考察初始pH值对酶活的影响，结果见图4。

图3 不同氮源对酶活的影响Fig.3 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity

图4 初始pH值对酶活的影响Fig.4 Effect of initial pH value on enzyme activity

从图4可以看出，随着初始pH值的不断增大，酶活逐渐降低，在初始pH值为4.0时,酶活最高，为448 U·mL-1。

2.2.4 发酵时间

以玉米芯粉+蔗糖(1∶2)为复合碳源、硝酸铵为氮源，在初始pH值为4.0的条件下发酵96 h，每隔12 h测定一次酶活，考察发酵时间对酶活的影响，结果见图5。

图5 发酵时间对酶活的影响Fig.5 Effect of fermentation time on enzyme activity

从图5可以看出，发酵12～60 h，酶活波动较大，但总体呈上升趋势；发酵60 h时，酶活达到最高，为488 U·mL-1；之后，酶活随着发酵时间的延长逐渐降低。

2.2.5 发酵温度

以玉米芯粉+蔗糖(1∶2)为复合碳源、硝酸铵为氮源，在初始pH值为4.0的条件下，分别在15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃发酵60 h，测定酶活，考察发酵温度对酶活的影响，结果见图6。

图6 发酵温度对酶活的影响Fig.6 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

从图6可以看出，当发酵温度为30 ℃时，酶活最高，为511 U·mL-1。

2.3 产酶条件的多因素优化

2.3.1 实验设计

在单因素优化实验的基础上，设置初始pH值为4.0、发酵温度为30 ℃、摇床转速为170 r·min-1，用Design-Expert软件对碳源、氮源和发酵时间进行多因素优化实验，结果见表1。

2.3.2 效应面优化与预测

根据多因素优化实验中的碳源、氮源和发酵时间的不同取值，得到对应的酶活值，利用Design-Expert软件绘制各因素的交互作用对酶活影响的三维曲面图，如图7所示。

按照上述限定的优化条件，确定优化方案为：X1=4.09%、X2=1.16%、X3=3.14 d，Y=640 U·mL-1。

2.3.3 验证实验

在优化方案下，即复合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量为4.09%、氮源硝酸铵添加量为1.16%、初始pH值为4.0、发酵时间为3.14 d、发酵温度为30 ℃，分3批(每批3组)进行验证实验。第一批：642 U·mL-1、646 U·mL-1、635 U·mL-1，平均值641 U·mL-1；第二批：629 U·mL-1、650 U·mL-1、641 U·mL-1，平均值640 U·mL-1；第三批：630 U·mL-1、646 U·mL-1、650 U·mL-1，平均值642 U·mL-1；3批平均值为641 U·mL-1，与预测值非常接近，比单因素实验的最佳酶活值提高了25.44%。

表1Design-Expert多因素优化实验结果(n=3)

Tab.1

Results of multi-factors optimization

3 结论

以木聚糖为唯一碳源，从含有大量腐烂枯枝树叶的土壤中筛选出若干菌株，利用DNS法筛选得到一株产酶量最高的目标菌株。经过单因素实验，确定最佳的碳源、氮源、初始pH值、发酵时间和发酵温度；然后利用Design-Expert软件对碳源、氮源和发酵时间进行响应面分析，得到了最佳的发酵产酶条件：复合碳源(玉米芯粉∶蔗糖=1∶2)添加量为4.09%、氮源硝酸铵添加量为1.16%、初始pH值为4.0、发酵时间为3.14 d、发酵温度为30 ℃，在此条件下，所产木聚糖酶的酶活达到641 U·mL-1，比单因素实验提高了25.44%。该研究为生物法利用半纤维素、加快我国秸秆资源生物法利用、缓解我国能源资源的短缺和环境污染的压力提供了一条有效途径。

图7 各因素的交互作用对酶活影响的三维图Fig.7 Three dimensional diagram for effects of interaction of each factor on enzyme activity

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ScreeningofAXylanase-ProducingStrainandOptimizationinFermentationConditions

ZHANG Qing-fang1，2,XU Jing2,YANG Xu-li2，GUO Sai-sai2

(1.SchoolofEnergyandPowerEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China;
2.SchoolofPetrochemicalEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China)

Using xylan as a sole carbon source,we screened a high xylanase-producing strain from soil which contained a lot of rotten dead branch leaves.The strain belongs toStreptomycesby morphological analysis and molecular biology identification.We investigated the effects of carbon source,nitrogen source,initial pH value,fermentation temperature,and fermentation time on enzyme activity by single-factor experiment.On the basis of single-factor experiment,we carried out the response surface analysis of carbon source,nitrogen source,and fermentation time by Design-Expert software.The single-factor experiment showed that the enzyme activity of xylanase was 511 U·mL-1when the appropriate fermentation conditions were as follows:composite carbon source was corncob powder and sucrose(1∶2),nitrogen source was ammonium nitrate,initial pH value was 4.0,fermentation time was 2.5 d,and fermentation temperature was 30 ℃.The response surface analysis showed that the enzyme activity of xylanase reached 641 U·mL-1which increased by 25.44% over that of single-factor experiment when the optimal fermentation conditions were as follows:the addition of composite carbon source(corncob powder∶sucrose=1∶2) was 4.09%,the addition of nitrogen source ammonium nitrate was 1.16%,initial pH value was 4.0,fermentation time was 3.14 d,and fermentation temperature was 30 ℃.

hemicellulase;xylanase;fermentation;response surface analysis

TQ920 Q814.1

A

1672-5425(2017)10-0020-05

国家自然科学基金项目(21667017)

2017-05-21

张庆芳(1972-)，女，甘肃天水人，副教授，主要从事固体废物资源化与能源化的科研与教学工作，E-mail:zhangqingfang_19@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.005

张庆芳，许晶，杨旭立，等.一株产木聚糖酶菌株的筛选及发酵产酶条件优化[J].化学与生物工程，2017，34(10)：20-24，31.