高效液相色谱-电喷雾式检测器测定生物质制乙酰丙酸反应中纤维素水解产物的单糖组成

刘俊彦，李继文，王 川

(中国石化上海石油化工研究院，上海 201208)

高效液相色谱-电喷雾式检测器测定生物质制乙酰丙酸反应中纤维素水解产物的单糖组成

刘俊彦，李继文，王 川

(中国石化上海石油化工研究院，上海 201208)

建立了高效液相色谱-电喷雾式检测器测定生物质制乙酰丙酸反应中纤维素水解产物的单糖组成的方法。采用XBridge Amide C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，以85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)为流动相，色谱柱温70 ℃，流速1 mL·min-1，分析周期10 min。标样测定结果表明，各目标化合物在一定浓度范围内呈良好的线性响应，回归系数(R2)均大于0.99，最低检出限为0.001 g·L-1。实际样品的加标回收率在89.74%～107.58%之间，6次重复测定的相对标准偏差(RSD)均小于3%。该方法分析速度快，灵敏度高，分离效果好，结果准确可靠，数据精密度良好，无需进行糖类衍生化反应，为纤维素水解产物的单糖组成分析提供了一种新的简便、快速、准确的方法。

高效液相色谱；电喷雾式检测器；纤维素；单糖；生物质；乙酰丙酸

随着自然资源的不断消耗，积极探寻和开发新能源体系迫在眉睫，由可再生的生物质原料生产平台化合物的探索已成为研究热点[1-2]。平台化合物具有非常好的反应特性，可以衍生出众多高附加值的下游产品，为化工行业开辟出新的应用领域[3]。乙酰丙酸作为一种重要的平台化合物备受关注[4-5]。乙酰丙酸通过各类化学反应可制得塑料改性剂、溶剂、香料、农药中间体、聚合物添加剂、润滑油添加剂、化妆品添加剂等[6-9]。目前，乙酰丙酸可由生物质纤维素水解成六碳糖单体和低聚物，在高温酸性条件下继续降解成5-羟甲基糠醛后转化得到[10-14]。纤维素水解为单糖是重要的反应步骤，快速准确获得产物中单糖的定量信息，对优化生物质转化反应条件有着决定性作用。

糖类化合物可以通过液相色谱进行分离，但因其不含发色基团，因此通过常规手段(如紫外检测)对其进行直接检测比较困难。针对糖类的非痕量分析，可以使用示差折光[15]、蒸发光散射[16-18]等技术进行检测；针对糖类的痕量分析，可以采用柱前衍生-高效液相色谱方法配合紫外或荧光检测器进行检测。使用紫外检测器，可以采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)进行柱前衍生；使用C18反相色谱柱，紫外检测波长为250 nm[19-20]；使用荧光检测器，可以采用氨基吡啶类、酰肼类、苯胺类、氨基苯甲酸酯类荧光试剂进行柱前衍生，实现痕量糖类的高灵敏度分析[21]。柱前衍生方法的检测灵敏度较高，但衍生反应相对耗时。针对不同的样品体系，需要使用适当的预处理方法方可进行衍生化反应。

电喷雾式检测器(CAD)是一种通用型液相色谱检测器，具有不依赖化学结构的信号响应一致性[22]，适用于分析各种不挥发或挥发性较差的化合物，尤其对不能使用紫外检测器检测的化合物(如糖类等)具有较大的优势[23-25]。

基于现有的HPLC分析糖类化合物的方法，作者选择合适的色谱柱与流动相，将HPLC-CAD技术应用于生物质制乙酰丙酸流程中的纤维素水解产物单糖组成的分析，使用CAD对目标化合物进行定量分析，拟为新型工艺开发提供一种新的简便、快捷、准确的分析方法。

1 实验

1.1 试剂与仪器

木糖、果糖、葡萄糖、甲酸、甲酸铵纯度均大于99%，氨水(纯度28%)，Sigma公司；乙腈(HPLC级)，Thermofisher公司；Milli-Q超纯水。

Thermo Ultimate 3000型HPLC-CAD，Amide色谱柱(Waters，XBridge，4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，Amino色谱柱(Thermo Scientific，Hypersil GOLD，4.6 mm×150 mm，5 μm)。

1.2 标准溶液的配制

分别称取各标准品化合物溶于超纯水中，配制成10 g·L-1的标准溶液储备液。分别吸取适量标准溶液储备液，用50%乙腈水溶液稀释，即得1#～5#系列标准溶液(化合物浓度为0.05～2.00 g·L-1)。

1.3 HPLC-CAD分析条件

HPLC采用等度洗脱模式，流动相为85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)，流速为1 mL·min-1， 色谱柱温为70 ℃，进样量为10 μL。CAD雾化气为N2，雾化气压力为0.2 MPa，雾化温度为30 ℃。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择

CAD 与蒸发光散射检测器(evaporative light scattering detector，ELSD) 都是基于雾化-气溶胶的高效液相色谱检测器，通过雾化蒸发液相色谱流动相后对目标化合物进行检测。2种检测器均可作为紫外检测器的补充，对于检测无紫外吸收或吸收较弱的化合物具有一定优势。CAD与ELSD的区别在于：CAD是基于带电粒子的电信号,ELSD则基于目标化合物散射光信号。与ELSD相比，CAD在低浓度范围具有更好的线性响应，因此更适用于液相色谱梯度洗脱分离条件。

2.2 色谱柱的选择

通常使用氨基柱(Amino色谱柱)对单糖进行分离，采用等度洗脱模式，流动相为85%乙腈水溶液。在该色谱条件下，使用CAD对目标化合物进行分析，结果见图1。

图1 等度洗脱模式下，Amino色谱柱分离3种单糖的典型图谱Fig.1 Typical spectrum of three monosaccharideswith Amino column at isocratic elution

从图1可以看出，3种单糖未能完全基线分离。因此，尝试使用以酰胺键为固定相基团的Amide色谱柱对目标化合物进行分离。

2.3 流动相的选择

使用Amide色谱柱对单糖进行分离，采用等度洗脱模式，以85%乙腈水溶液为流动相时的典型图谱如图2a、b、c所示，在85%乙腈水溶液流动相中分别添加5 mmol·L-1甲酸铵、0.1%甲酸、0.0025%氨水的典型图谱如图2d、e、f所示，在85%乙腈水溶液流动相中添加不同浓度氨水的典型图谱如图2g、h、i所示。

流动相：a～c为85%乙腈水溶液，d为85%乙腈水溶液+5 mmol·L-1甲酸铵，e为85%乙腈水溶液+0.1%甲酸，

由图2a、b、c可以看出，以85%乙腈水溶液为流动相时，3种单糖均出现了色谱峰分叉现象，且提高色谱柱温不能明显改善峰型。由图2d、e、f可以看出，在85%乙腈水溶液流动相中加入甲酸铵或甲酸后，3种单糖的分离效果更差；加入0.0025%氨水则可以明显改善色谱峰型(柱温为70 ℃)。由图2f、g、h可以看出，70 ℃下，提高85%乙腈水溶液流动相中的氨水浓度有利于改善色谱峰型，以0.025%氨水效果最佳，氨水浓度过高对色谱分离效果没有明显改善(图2h)。

目前尚未有文献报道过单糖标准品在Amide色谱柱上峰分叉现象，可能是由于单糖分子存在旋光异构现象导致。常规Amino色谱柱对旋光异构体没有区分，因此不存在峰分叉的现象。Amide色谱柱可能由于固定相官能团与单糖具有特殊的相互作用，因此产生峰分叉现象。氨水可能对单糖具有消旋作用，驱使单糖以单一空间结构的形态存在，从而改善色谱峰型。

2.4 色谱柱温与流速的选择

分别考察70 ℃与40 ℃条件下，用含有0.025%氨水的85%乙腈水溶液作为流动相的分离效果(图2g、i)，结果发现，较高的色谱柱温可以改善色谱峰型与分离度。

进一步比较0.7 mL·min-1与1 mL·min-1流速下的分离效果，结果发现，低流速条件下没有明显改善各单糖的分离效果，并导致色谱峰变宽，降低了检测灵敏度。因此，选择流速为1 mL·min-1。

2.5 线性关系与最低检出限

对1#～5#系列标准溶液进行分析，以各化合物CAD信号面积对含量进行线性回归，分别得到目标化合物的线性方程、线性范围、回归系数(R2)与最低检出限(LOD，S/N=3)，每份标准溶液测定6次，取平均值，结果见表1。

表1目标化合物的线性关系与最低检出限

Tab.1Linear relationship and limit of detection

从表1可以看出，各化合物在各自的含量范围内具有良好的线性关系。

2.6 准确性与精密度

为了考察HPLC-CAD方法的准确性和精密度，在实际样品中进行加标回收率与重复性实验。将实际样品加标配制2个不同浓度的标样Ⅰ和Ⅱ，分别进行定量分析，每个标样重复测定6次，结果见表2。

表2HPLC-CAD方法的回收率与重复性

Tab.2RecoveryrateandrepeatabilityofHPLC-CADmethod

化合物加入量g·L-1实测值g·L-1RSD%回收率%标样Ⅰ木糖1.211.141.8593.94果糖1.301.321.14101.81葡萄糖1.551.671.76107.58标样Ⅱ木糖0.740.662.3689.74果糖0.620.581.9993.58葡萄糖0.810.742.0791.66

从表 2可知，各加标组分的回收率在89.74%～107.58%之间，相对标准偏差(RSD)(n=6)均小于3%，说明该方法定量结果准确可靠，数据精密度良好。

2.7 实际样品测定

采用 1.3色谱条件和2.5测得的线性方程，对实际样品进行分析，结果见表3。

从表3可以看出，定量分析结果的重复性良好。

表3实际样品测定结果(n=6)

Tab.3Determinationresultsofpracticalsamples(n=6)

化合物浓度/(g·L-1)RSD/%木糖0.861.41果糖0.712.07葡萄糖1.161.97

3 结论

采用HPLC-CAD技术实现了生物质制乙酰丙酸反应中纤维素水解产物单糖组分的定性和定量分析。采用XBridge Amide C18色谱柱(4.6 mm×150 mm，3.5 μm)，以85%乙腈水溶液(含0.025%氨水)为流动相，色谱柱温70 ℃，流速1 mL·min-1，分析周期10 min。标样测定结果表明，各目标化合物在一定浓度范围内呈良好的线性响应，回归系数(R2)均大于0.99，最低检出限为0.001 g·L-1。实际样品的加标回收率在89.74%～107.58%之间，相对标准偏差(RSD)均小于3%。该方法分析速度快，灵敏度高，分离效果好，结果准确可靠，数据精密度良好，无需进行糖类衍生化反应，为纤维素水解产物的单糖组成分析提供了一种新的简便、快速、准确的方法。

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DeterminationofMonosaccharideCompositioninCelluloseHydrolysateDuringtheProductionofLevulinicAcidfromBiomassbyHighPerformanceLiquidChromatographywithChargedAerosolDetection

LIU Jun-yan,LI Ji-wen,WANG Chuan

(SINOPECShanghaiResearchInstituteofPetrochemicalTechnology,Shanghai201208,China)

We established the determination method of monosaccharide composition in cellulose hydrolysate during the production of levulinic acid from biomass by high performance liquid chromatography(HPLC) with charged aerosol detection(CAD).Using 85% acetonitrile water solution containing 0.025% ammonia as an mobile phase,an XBridge Amide C18column(4.6 mm×150 mm,3.5 μm) was applied for the separation coupled with CAD within 10 min,the column temperature was 70 ℃,and the flow rate was 1 mL·min-1.Determination results of standard samples showed a good linear relationship with the corresponding concentration,and the linear regression coefficients were greater than 0.99.The limit of detection of the method was 0.001 g·L-1.The adding standard recoveries of real samples were 89.74%～107.58%,and relative standard deviation(RSD) was less than 3% for six repeatable detection.The method provides a new strategy for simple,rapid,and accurate analysis of monosaccharide composition in cellulose hydrolysate during the production of levulinic acid from biomass with fast analysis,high sensitivity,good separation efficiency,accuracy and reliability,good precision,and no glycosyl derivatization.

high performance liquid chromatography;charged aerosol detection;cellulose;monosaccharide;biomass;levulinic acid

O657.72

A

1672-5425(2017)10-0065-05

2017-04-26

刘俊彦(1984-)，男，上海人，博士，高级工程师，研究方向：色谱质谱联用技术，E-mail:liujy.sshy@sinopec.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.10.015

刘俊彦，李继文，王川.高效液相色谱-电喷雾式检测器测定生物质制乙酰丙酸反应中纤维素水解产物的单糖组成[J].化学与生物工程，2017，34(10)：65-69.