比较2种造模方法对家兔膝骨关节炎模型的血清及关节液中炎性因子的影响※

杨 帆 袁 芳 朱跃兰

(北京中医药大学2015级博士研究生，北京 100029)

比较2种造模方法对家兔膝骨关节炎模型的血清及关节液中炎性因子的影响※

杨 帆 袁 芳1朱跃兰△

(北京中医药大学2015级博士研究生，北京 100029)

目的检测2种造模方法制备的家兔膝骨关节炎(KOA)模型的血清及关节液中炎性因子含量，分析2种造模方法对家兔KOA模型的血清及关节液中炎性因子的影响。方法将10只新西兰大白兔随机分为模型1组、模型2组，每组5只。模型1组采用改良后伸直位固定法制备KOA模型；模型2组采用双侧膝关节腔内注射药物法制备KOA模型。观察2组家兔的一般状态并记录体质量、患侧膝关节宽度及Lequesne指数。比较2组家兔造模后血清及关节液中炎性因子[前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]含量水平。结果模型2组首次注射木瓜蛋白酶溶液后及模型1组膝关节制动后的1周内，家兔出现精神萎靡，进食量减少，活动灵活性减低，患侧肢体跛行，甚至蹬地无力伴疼痛、回头舔吮等状态。2组家兔造模前后体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2组家兔造模后患侧膝关节宽度均较本组造模前增加(P<0.05)，模型2组造模后患侧膝关节宽度较模型1组增加(P<0.05)。2组家兔造模前后Lequesne指数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2组家兔造模后Lequesne指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。2组家兔造模后血清中PGE2、IL-1β及TNF-α含量比较差异均有统计学意义(P<0.05)，模型2组高于模型1组。2组家兔关节液中IL-1β及TNF-α含量比较差异均有统计学意义(P<0.05)，模型2组高于模型1组；PGE2含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论2种造模方法对家兔的一般生活状态影响不大，而对其血清及关节液中炎性因子影响较为明显。

骨关节炎，膝；动物，实验

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是临床常见的一种严重影响人类健康生活的疾病，主要表现为关节疼痛、僵硬及功能活动障碍等症状[1]。其主要病理特征是关节内软骨破坏，具有发病缓慢、呈渐进性退变的特点[2]，在生物学和力学因素共同作用下形成[3]。近年来，骨关节疾病增多，尤以膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)为主，随着人们生活水平的提高，追求高水平的生活质量也日趋受到重视，因此对KOA的基础研究也逐渐深入。目前本病病因及发病机制仍不十分清楚，因此建立相应的KOA模型以研究其病理机制及防治方法具有重要意义。

在KOA发病过程中，关节内软骨细胞因炎性因子增多而破坏加重，因此通过检测动物血清及关节液中炎性因子的含量水平，可分析KOA严重程度。我们在查阅相关文献[4-9]的基础上，选取2种家兔KOA的造模方法：改良后伸直位固定法和双侧膝关节腔内注射药物法。2种方法都较为成熟且常用，但对所造成的KOA炎性因子含量水平之间的差异尚不明确。本实验通过建立以上2种家兔KOA模型，检测家兔血清及关节液中炎性因子的含量，比较并分析2种造模方法之间的异同点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 清洁级健康新西兰大白兔10只，购于北京市海淀区兴隆实验动物养殖厂，动物合格证号：SCXK(京)2016-0003，10周龄，体质量2 kg左右，饲养于中国人民解放军陆军总医院骨科实验室，均单笼饲养，自由摄食、饮水，自然光线照射，室温20～22 ℃，湿度46%～60%。

1.1.2 实验试剂及仪器 实验试剂：木瓜蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司，批号：325A0210)，青霉素G钠盐(北京索莱宝科技有限公司，批号：916B0213)，水合三氯乙醛(国药集团化学试剂有限公司，批号：20150812)，碘伏消毒液(德州安捷高科消毒制品有限公司，批号：20141202)，75%医用酒精(北京鸿志伟达工贸有限公司朝阳卫生用品分公司，批号：20150910)，0.9%氯化钠注射液(石家庄四药有限公司，国药准字H13023200)，前列腺素E2(PGE2)、白细胞介素1β(IL-1β)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，均由北京欧北生物科技有限公司提供。造模材料：医用高分子绷带(规格：7.5 cm×360 cm，苏州元康医疗器械有限公司)，医用脱脂棉，医用纱布，医用胶带。行为学测试材料：游标卡尺，关节测量医用测角尺。仪器：电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，Eppendorf高速离心机(Eppendorf AG 22331 Hamburg Germany，5810R型)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将10只新西兰大白兔随机分为模型1组、模型2组，每组5只。

1.2.2 模型制备

1.2.2.1 模型1组 采用改良后伸直位固定法，即右后肢伸直位固定制动法制备KOA模型[4-7]。将家兔仰卧位固定于兔固定台上，牵拉右后肢使其处于完全伸直位，将医用脱脂棉垫在医用高分子绷带内侧，从腹股沟至足趾固定家兔的右后肢(膝关节伸直呈180 °，踝关节背屈呈60 °)，用医用纱布将医用高分子绷带固定好，待其定型后外套丝袜以防动物撕咬，再用医用胶带将丝袜固定，剪开丝袜留出足趾以便观察右后肢血供或肿胀等情况，固定制动6周。注意事项：①如足趾肿胀严重或有坏死倾向，立即拆除全部固定，待肿胀消退后再重新固定。②家兔制动后行动不便，可能会出现健侧肢体卡在金属笼空隙中等情况，需注意观察，如出现上述情况，立即拆除全部固定，待卡住的肢体恢复正常血供1～2 d后再行固定。③若固定部位磨损皮肤，严重者出现感染等情况，立即肌肉注射青霉素G钠盐溶液(将青霉素G钠盐2.0×105U溶于0.9 %氯化钠注射液0.5 mL中)0.5 mL，连续肌肉注射3 d。

1.2.2.2 模型2组 采用双侧膝关节腔内注射药物法制备KOA模型[8-9]。配制木瓜蛋白酶溶液(将木瓜蛋白酶0.25 g溶于0.9%氯化钠溶液5 mL中)，将家兔双侧后肢弯曲，充分暴露膝关节，每次向双侧膝关节腔内各注入木瓜蛋白酶溶液0.5 mL。对5只实验家兔分别于造模第1、4、7 d行3次双侧膝关节腔内注射，以强化造模效果。3次双侧膝关节腔内注射后再观察1周。注意事项：膝关节腔内注射时应严格按照无菌操作规范进行，防止给药局部出现感染等情况，若出现严重感染，立即肌肉注射青霉素G钠盐溶液0.5 mL，连续肌肉注射3 d。

1.3 观察指标 在实验过程中，观察2组家兔的一般状态并用体质量秤称取动物体质量、用游标卡尺测量患侧膝关节最大宽度，用Lequesne指数对动物进行行为学评分。比较2组家兔造模后血清及关节液中炎性因子含量水平。

1.4 Lequesne指数检测 分别于造模前后采用Lequesne指数对2组家兔患肢疼痛、步态、关节活动、关节肿胀程度进行测量评估。要求由2名评分人员同时对实验家兔进行评估并各自打分，结果取平均值，2次评估人员相同。Lequesne指数评分标准[10]见表1。

表1 Lequesne指数评分标准

1.5 动物标本处理方法 造模成功后，用10%水合三氯乙醛溶液按3 mL/kg经耳缘静脉麻醉后，分别于颈总动脉取血及患侧膝关节内抽吸0.9%氯化钠注射液灌注液，经3 000 r/min离心15 min后取上清液，分装于离心管内，做好标记后置于-80 ℃冰箱保存。利用ELISA法按其试剂盒提供的操作流程，分别对血清及关节液中的PGE2、IL-1β及TNF-α含量进行测定。

2 结 果

2.1 2组家兔一般状态比较 在整个实验过程中，所有家兔均存活，但模型2组首次注射木瓜蛋白酶溶液后及模型1组膝关节制动后的1周内，家兔出现精神萎靡，进食量减少，活动灵活性减低，患侧肢体跛行，甚至蹬地无力伴疼痛、回头舔吮等状态。

2.2 2组家兔造模前后Lequesne指数比较 见表2。

表2 2组家兔造模前后Lequesne指数比较 分

与本组造模前比较，*P<0.05

由表2可见，2组家兔造模前后Lequesne指数比较差异均有统计学意义(P<0.05)。2组家兔造模后Lequesne指数比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 2组家兔造模前后体质量及患侧膝关节宽度比较 见表3。

模型1组(n=5)造模前造模后模型2组(n=5)造模前造模后体质量(kg)2．08±0．842．52±0．222．06±0．552．42±0．13患侧膝关节宽度(mm)15．58±0．8618．64±0．85∗△16．10±0．7021．17±0．72∗

与本组造模前比较，*P<0.05；与模型2组造模后比较，△P<0.05

由表3可见，2组家兔造模前后体质量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。2组家兔造模后患侧膝关节宽度均较本组造模前增加(P<0.05)，模型2组造模后患侧膝关节宽度较模型1组增加(P<0.05)。

2.4 2组家兔造模后血清及关节液中炎性因子水平比较 见表4。

组 别模型1组(n=5)血清关节液模型2组(n=5)血清关节液PGE295．17±16．51∗86．86±12．89124．42±21．16108．29±24．43IL-1β17．28±2．02∗27．61±5．23∗28．61±5．0340．06±10．70TNF-α15．06±2．23∗18．17±1．51∗22．64±3．1726．75±2．28

与模型2组比较，*P<0.05

由表4可见，2组家兔造模后血清中PGE2、IL-1β及TNF-α含量比较差异均有统计学意义(P<0.05)，模型2组高于模型1组。2组家兔关节液中IL-1β及TNF-α含量比较差异均有统计学意义(P<0.05)，模型2组高于模型1组；PGE2含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3 讨 论

在KOA的基础研究中，因家兔膝关节具有关节面较宽、取材量较多且容易等特点，结构又与人类相近，所以多选其作为KOA的动物模型以便研究本病的病程进展、组织病理学特征或筛选诊疗方法等。对于KOA家兔的造模方法也多种多样，有手术切除膝关节韧带或结扎血管[11]、石膏固定膝关节制动方法[12]、直接向膝关节腔内注射药物局部破坏关节软骨[13]等，不同的造模方法有不同的优势，针对不同的KOA成因可采用不同的方法。研究发现，关节腔内注射木瓜蛋白酶溶液引起的骨关节炎[14-15]，具有实验总体时间短、重复性好、成功率高、造模成型周期短等优点，且病变典型，过程清晰，与人类KOA相似度高[16-17]。

炎性因子在KOA的进展过程中具有重要作用。其中PGE2就是参与软骨基质破坏的主要炎性因子，它可参与激活破骨细胞，促进血管新生，破坏骨与软骨正常组织结构，促进炎性介质的产生，同时PGE2又是重要的致痛因子，是造成关节疼痛的主要原因[18]。IL-1β主要作用于关节软骨，它能抑制透明软骨特征性的Ⅱ型胶原蛋白合成，反而促进Ⅰ或Ⅲ型胶原蛋白合成，从而影响软骨细胞正常代谢，使软骨细胞变形，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖合成[19-20]，进而加重骨关节炎的病情程度。TNF-α是一种多功能炎性因子，主要作用于滑膜，刺激滑膜细胞产生PGE2，从而间接使骨与软骨发生破坏[21]。大量研究表明TNF-α还能诱导IL-1β产生，而IL-1β和TNF-α均能刺激PGE2生成，因此3种炎性因子互相协同作用，共同加重关节内软骨破坏，加速骨关节炎疾病进展。

本实验研究发现，2组不同的造模方法均可使实验家兔的体内血清中及局部的膝关节腔内出现大量的炎性因子PGE2、IL-1和TNF-α，表明不同的方法均可促进KOA形成，加重疾病严重程度。但血清及关节液中炎性因子的含量水平有所不同，通过膝关节腔内直接注射木瓜蛋白酶溶液的方法，炎性因子的含量较膝关节制动增加明显(P<0.05)，说明膝关节腔内直接注射药物法能够使实验家兔的KOA疾病的严重程度变化更明显。通过肉眼大体观察2组家兔患侧膝关节宽度均增加，游标卡尺测量结果也显示进行膝关节内注射法干预的家兔增加明显。但2组家兔的一般活动状态与体质量变化情况相似，Lequesne指数也相近，比较差异均无统计学意义(P>0.05)，可见2组实验家兔在一般状态及膝关节功能活动表现上差异并不明显。因此认为，若肉眼直观KOA实验家兔的一般活动状态与体质量变化情况，则2种造模方法均可适用，若需检测模型的炎性因子水平情况，则膝关节腔内注射木瓜蛋白酶溶液的方法较膝关节固定制动方法变化更为明显。

综上，相较膝关节固定制动法，用膝关节腔内注射药物的方法在复制KOA动物模型方面，更为省时、省力且经济，同时效果稳定，与人类KOA的发病机制相近，是建立KOA动物模型的理想方法。同时操作者的操作技能、无菌技术及动物护理对造模结果亦有很大影响，研究者需考虑实验具体需求，采用最合适的造模方法。

[1] 中华医学会风湿病学分会.骨关节炎诊断及治疗指南[J].中华风湿病学杂志，2010，(6):416-419.

[2] 姜玉宝，林昌松，李楠，等.骨痹方治疗肾虚血瘀型膝骨关节炎的疗效观察及对软骨高频超声的影响[J].中国实验方剂学杂志，2017,23(8):166-168.

[3] Mallen CD，Peat G，Thomas E，et al.Predicting poor functional outcome in community-dwelling older adults with knee pain:prognostic value of generic indicators[J].Ann Rheum Dis，2007，66(11)：1456-1461.

[4] Okazaki R，Sakai A，Ootsuyama A，et al.Apoptosis and p53 expression in chondrocytes relate to degeneration in articular cartilage of immobilized knee joints[J].J Rheumatol，2003，30(3):559-566.

[5] 张洪，江捍平，王大平，等.关节制动制作骨性关节炎动物模型的探讨[J].中国现代医学杂志，2006，16(12):1843-1844,1848.

[6] 苏新平，朱克俭，谭旭仪.止痛健骨方对兔膝骨关节炎模型滑膜及软骨修复的影响[J].湖南中医药大学学报，2016，36(4):11-14.

[7] Muehleman C，Green J，Williams JM，et al.The effect of bone remodeling inhibition by zoledronic acid in an animal model of cartilage matrix damage[J].Osteoarthritis Cartilage，2002，10(3):226-233.

[8] Havdrup T，Telhag H.Papain-induced changes in the knee joints of adult rabbits[J].Acta Orthop Scand，1977，48(2):143-149.

[9] 韩冠英，凌沛学，王凤山，等.不同浓度木瓜蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的比较研究[J].中国骨伤， 2012，28(5):424-429.

[10] Lequesne MG,Mery C,Samson M，et al.Indexes of severity for osteoarthritis of the hip and knee.Validation--value in comparison with other assessment tests[J].Scand J Rheumatol Suppl，1987，65:85-89.

[11] 李登晓，徐璇，朱洁，等.滑膜炎胶囊对兔膝骨性关节炎组织病理学及NO、SOD、COMP等的影响[J].上海中医药杂志，2014，48(4):86-90，101.

[12] 林庆荣.臭氧对兔膝骨关节炎的作用及机制研究[D].广州：南方医科大学,2011.

[13] 汪福东，郭义娟，董立新，等.抗骨增生片对兔膝骨关节炎软骨中白细胞介素-1β、转化生长因子-β1表达的影响[J].河北中医，2013，35(10):1557-1559.

[14] Murat N，Karadam B，Ozkal S，et al.Quantification of papain-induced rat osteoarthritis in relation to time with the Mankin score[J].Acta Orthop Traumatol Turc，2007，41(3)：233-237.

[15] 杨峰，史宗道.用木瓜蛋白酶建立兔颞颌关节骨关节炎模型的研究[J].华西口腔医学杂志，2002，20(5):330-332.

[16] Aigner T，Cook JL，Gerwin N，et al.Histopathology atlas of animal model systems-overview of guiding principles[J].Osteoarthritis Cartilage，2010，Suppl 3:S2-6.

[17] 邓宇，伍筱梅，任医民，等.关节腔内注射不同蛋白酶建立兔膝骨关节炎模型的对比研究[J].中华关节外科杂志：电子版，2009，3(3):38-41.

[18] 徐海涛，陈游，孟国成，等.不同干预因素对膝骨关节炎患者滑液中前列腺素E2的影响[J].食品与药品，2007,9(9):29-31.

[19] Daheshia M,Yao JQ.The interleukin 1beta pathway in the pathogenesis of osteoarthritis[J].J Rheumatol，2008，35(12):2306-2312.

[20] Hoberg M，Rudert M，Pap T，et al. Attachment to laminin-111 facilitates transforming growth factor beta-induced expression of matrix metalloproteinase-3 in synovial fibroblasts[J].Ann Rheum Dis，2007，66(4):446-451.

[21] Alexander D，Friedrich B，Abruzzese T，et al.The active form of leflunomide,HMR1726,facilitates TNF-alpha and IL-17 induced MMP-1 and MMP-3 expression[J].Cell Physiol Biochem，2006，17(1-2)：69-78.

(本文编辑：习 沙)

Comparisontheeffectsoftwomodelingmethodsoninflammatoryfactorsinserumandsynovialfluidofrabbitkneeosteoarthritismodel

YANGFan*,YUANFang,ZHUYuelan.

*2015-GradeDoctoralCandidateofBeijingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Beijing100029

ObjectiveTo detect the content of inflammatory factors in serum and synovial fluid of rabbit knee osteoarthritis (KOA) model by two modeling methods, and analyze the effects of two modeling methods on inflammatory factors in serum and synovial fluid of rabbit KOA model.Methods10 New Zealand white rabbits were randomly divided into model group 1, model group2, 5 rabbits in each group. The KOA model in model group 1 was prepared by the modified methods of immobilization in extension position. The KOA model in model group 2 was prepared by intracavitary injection drug of bilateral knee. The general state of rabbits were observed, and the body mass, the width of affected side knee joint and Lequesne index were recorded in two groups. The levels of inflammatory factors including prostaglandin E2(PGE2), interleukin-1 beta (IL-1β), tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) in serum and synovial fluid after model establishment were compared in the two groups.ResultsAfter injection of papain solution for the first time in model group 2 and after braking knee in model 1, rabbits appeared apathetic, reduced food intake, reduced activity flexibility, affected side limb limping, and even pedal unable with suffer pain, turn back for lick and suck and other states within 1 week. There was no statistical difference on the body mass between before and after modeling in two groups (P>0.05). The width of affected side knee joint after modeling increased in the two groups (P<0.05), and the width of affected side knee joint after modeling in model group 2 was higher than that in model group 1 (P<0.05). There were statistical differences on the Lequesne index between before and after modeling in two groups (P<0.05). There was no statistical difference on the Lequesne index after modeling between the two groups (P>0.05). The contents of PGE2, IL-1β and TNF-α in serum in model group 2 were higher than those in model group 1 with statistical differences (P<0.05). The contents of IL-1β and TNF-α in synovial fluid in model group 2 were higher than those in model group 1 with statistical differences (P<0.05),and with no statistical difference on PGE2(P>0.05).ConclusionThe two modeling methods has no statistical difference on the general life status of rabbits, but has obvious influences on inflammatory factors in serum and synovial fluid

Osteoarthritis; Knee; Animal; Experiment

R684.3；R684.305；R-331

A

1002-2619(2017)09-1368-05

2017-06-01)

※ 项目来源：北京市科技计划课题(编号：Z151100003815013)

△ 通讯作者：北京中医药大学东方医院风湿科，北京 100078

1 首都医科大学附属北京中医医院针灸中心，北京 100010

杨帆(1990—)，女，博士研究生在读，硕士。研究方向：中医药防治风湿病。