猕猴桃果酒皂土下胶计量评估实验比较

郭 杰 ，孙中理 ，蔡海燕 ，余 杭 ，张 颖 ，张 翼

(1.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130； 2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川成都611130； 3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000)

猕猴桃果酒皂土下胶计量评估实验比较

郭 杰1，2，3，孙中理1，2，3，蔡海燕1，2，3，余 杭1，2，3，张 颖1，2，3，张 翼1，2，3

(1.四川省食品发酵工业研究设计院，四川成都611130； 2.酿酒生物技术及应用四川省重点实验室，四川成都611130； 3.国家固态酿造工程技术研究中心，四川泸州646000)

果酒产品常在货架期内因物理、化学或微生物不稳定而产生浑浊、失光或沉淀现象。这种现象极大影响了产品的感官品质及销售情况。生产中常用皂土下胶的方式避免其中因蛋白质不稳定而产生的浑浊沉淀问题。为预防皂土下胶过度或不足，常采用以下实验方法评估皂土下胶计量：三氯乙酸（trichloroacetic acid）试剂法、加热法及酒精沉淀法。本实验以梯度皂土计量的下胶方式对猕猴桃果酒进行处理后，对此3种方法进行实验比较。结果表明，三氯乙酸法所测定的下胶剂量较加热法高；加热法测定的下胶剂量接近自然条件下的沉淀剂量，其中6 h加热处理较30 min加热处理更适用于气温较高地区；酒精沉淀法在本实验中无法测定下胶剂量。

猕猴桃果酒； 蛋白质稳定； 下胶； 皂土

果酒产品常在货架期内因物理、化学或微生物不稳定而产生浑浊、失光或沉淀现象。这种现象极大影响了产品的感官品质及销售情况。在生产过程中，为了避免部分因蛋白质或多酚类物质不稳定而引起的浑浊沉淀现象，常采用澄清剂去除酒液中的不稳定蛋白或已经产生的悬浮浑浊物[1]，皂土便是果酒中的常用澄清剂之一。

皂土（Bentonite），又称膨润土或蒙脱土（Mont-morillonite），其通用化学式为 Al2O34SiO2·nH2O-内嵌离子。皂土主要的存在形态呈极小的片状结晶，且在水解过程中易形成胶体。水解后，四面体结构的SiO44-会在八面体结构的AlO66-上面与3个氧通过硅键链接（如图1），多个此结构通过氢键链接形成薄片结构。四面体和八面体结构的电荷数不同，使其表面带有负电荷，这也使得皂土薄片结构之间形成间隙，而内嵌的Na+或Ca2+的阳离子则存在于此间隙之间（见图2）。由于果酒中的酸性环境使蛋白质或多酚类分子带正电荷，所以在酒液环境内蛋白质分子会通过置换皂土间隙内的阳离子，形成沉淀，从而脱离酒液环境[2]。

图1 SiO44-与AlO66-结构及其链接

图2 蒙脱土结构示意图[1]

下胶过度可能导致下胶剂在酒液中有残留，或者去除了香气物质；而下胶不足则会导致部分未沉淀的不稳定蛋白或多酚类物质在装瓶之后，再次形成沉淀。对果酒进行下胶处理之前，为了预防因皂土下胶过度或者不足，常采取一系列的确定下胶剂量的相关试验手段。生产中常用的试验手段有：三氯乙酸（trichloroacetic acid）试剂测试法、加热测试法及酒精沉淀测试法。这些实验是通过分析下胶处理后的澄清酒液中的蛋白质稳定性来评估下胶剂量的。简单来说，在通过一定剂量的皂土下胶处理后，如测定其蛋白质的稳定性较高且满足相应的条件，则说明该剂量可以达到预期的效果，反之则说明剂量不足。3种实验方法沉淀蛋白质的机理分别为：三氯乙酸试剂测试能使蛋白质构象发生改变,使得蛋白质结构中的疏水集团暴露，从而聚集沉淀[3]；加热测试则是通过温度升高使得蛋白质的2级、3级、4级结构改变，从而聚集沉淀[4]；而酒精沉淀测试则是由于酒精可破坏蛋白质的水化层，从而使蛋白质的溶解度下降而析出沉淀。

因为这些蛋白质稳定性的测试实验机理不同，所以通过不同实验方法所推测的蛋白质稳定性存在一定差异。本实验采用梯度皂土剂量对猕猴桃酒进行下胶处理，然后通过4种方法测定其下胶剂量和预测蛋白质的稳定性，分析其结果的差异性。

1 材料与方法

1.1 材料

酒样：产自四川省什邡市红什2号猕猴桃所酿制的猕猴桃果酒。

仪器：小型Z6纸板过滤装置；50 mm，0.45 μm水系针头过滤器；水浴锅、离心机；SGZ-200A型浊度计。

1.2 试验方法

精确量取9份猕猴桃果酒酒液，每份700 mL，用完全水解的浓度为5%的皂土进行下胶处理。下胶皂土剂量分别为：0.1 g/L、0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4g/L，留1份700 mL未处理的酒液作为对照样。将每种酒液装瓶密封，放置在室温暗室沉淀7 d。所有酒液经过小型Z6纸板过滤机过滤、排气处理之后，将每种酒液依次进行以下蛋白质稳定性测试。

1.2.1 三氯乙酸试剂测试法

测定澄清酒液的初始浊度。精确抽取20 mL的澄清酒液移至大试管中，加入2 mL的55%三氯乙酸溶液，混合均匀后在沸水中加热2 min，冷却至室温后测量其浊度。

1.2.2 加热测试法

表1 三氯乙酸试剂测试结果表

取100 mL酒液至密封小瓶内。将小瓶置于80℃的恒温水浴加热锅内，加热30 min后，摇晃均匀后取出20 mL酒液，冷却至室温测量其浊度。剩余酒液继续加热5.5 h，取出冷却至室温，测量其浊度。

1.2.3 酒精沉淀处理法

取出20 mL澄清酒液测量其初始浊度，之后移至大试管加入20 mL的99.5%vol酒精，混合均匀，测量其浊度。

2 结果与分析

2.1 三氯乙酸试剂测试(见表1)

根据Berg和Akyoshi[5]的研究，Coleman Nephlos值约等于5.6倍差值浊度，根据其实验结果说明，Coleman Nephlos值与酒中蛋白质稳定程度的关系见表2。

表2 Coleman Nephlos与白葡萄酒中蛋白质稳定程度的关系[5]

三氯乙酸试剂测试结果表明（见表1），在下胶剂量小于等于0.8 g/L时，差值浊度随着下胶剂量的增加有着显著地降低，而在0.8～1.0 g/L时，差值浊度下降不明显，但是在0.8 g/L的Coleman Nephlos值达到稳定程度，所以在下胶剂量为0.8 g/L时，该猕猴桃果酒达到蛋白质稳定。

2.2 加热测试（表3、表4）

表3 80℃下加热30 min的处理结果

由表3、表4看出，30 min加热处理下的酒液，在0.4 g/L的下胶剂量达到蛋白质稳定，6 h加热处理下的酒液，在1.0 g/L的下胶剂量才达到稳定。在30 min加热测试中，0.1～0.4 g/L的下胶剂量区域内，各下胶计量之间差值浊度变化明显，其他样本区域变化不明显；在6 h加热测试中，0.1～0.8 g/L的下胶剂量区域内，各下胶计量之间差值浊度变化明显。这也说明经30 min加热处理后的酒液仍然存在蛋白质不稳定的潜在问题。

2.3 酒精沉淀实验

在酒精沉淀测试结果中发现（如表5），对于所有的下胶剂量差值浊度值都较大，且变化不明显，无法判定蛋白质稳定时的下胶剂量。

2.4 4种评估方法差值浊度与不同下胶计量对比(见图3)

由图3可知，通过酒精沉淀测定法处理的酒液所表现的差值浊度远远大于其他方法。其原因可能主要是因为所形成的悬浮颗粒，不仅仅有酒液中所析出沉淀的总蛋白质及多酚类物质，还有猕猴桃果酒中所含的多糖类物质[6]。因大部分多糖类物质与蛋白质相似，会随着酒精含量升高而使其溶解度降低，而达到过饱和形成沉淀。所以，即使经过1.4 g/L的皂土下胶处理，使酒液中脱去大部分蛋白质，但是无法脱去多糖类物质，这也就导致了多糖类物质会在酒精沉淀测试中表现出较大的NTU差值。此外，部分多糖类物质对酒中的有机酸盐稳定有促进作用[7]，所以可以推测，在随着酒精度的增加，多糖物质的沉淀，酒液中有机酸盐的溶解度降低，可能也会产生有机酸盐结晶，使其浊度增加。

表4 80℃下加热6 h的处理结果

表5 酒精沉淀测试结果

图3 4种评估方法差值浊度与不同下胶计量对比图

根据实验结果，用50%vol的酒精浓度所测量的每个样本之间差异性不大，无法用此推测应使用的下胶剂量。所以，在实验设计中或许应将添加无水酒精的剂量减少。正因为所添加酒精剂量缺少相应文献参考，再加上此法可使酒中的多糖物质沉淀，所以，此方法可能更推荐作为其他蛋白质稳定性测定方法的辅助，而不是作为主要的测量方法。

加热测定蛋白质稳定性的方法是目前在世界范围内最常用的方法，因为果酒在装瓶以后，形成沉淀或者澄清度降低的主要原因为环境温度的变化[8]。加热测试正是对自然条件下的极端化试验，比之其他实验更接近自然瓶装储存条件。比之30 min加热的测量方式，Bladwin[9]更加推荐使用6 h加热的测量方法，尤其是在夏季温度较高的地区。这是由于在气温较高的地区，瓶装成品酒的储存环境更容易产生蛋白质沉淀，所以也就需要更加严格的实验手段，来测量其下胶剂量。本实验也证实了6 h加热测量的下胶剂量高于30 min所测量的下胶剂量。通过比较两个加热试验的数据结果，发现几乎所有的差值浊度数据在6 h的加热处理中均大于30 min的，所以推测6 h的测量方法可能会有一定的过度测量。Nordestgaard等[10]也有同样的相关推测，6 h的加热处理不仅仅沉淀了葡萄酒中的蛋白性物质，其他物质也会在6 h的加热下而产生沉淀，降低葡萄酒的澄清程度。

三氯乙酸试剂测量方法为使蛋白质化学变性法。根据Esteruelas等[6]的实验，三氯乙酸的添加所沉淀的蛋白物质的量至少要比自然沉淀的量多出3倍，多糖类物质是自然沉淀的2倍。这个现象在本实验中也有所体现，在同等计量的条件下，三氯乙酸试剂有可能造成过度测量下胶剂量值。

3 结语

根据实验结果发现，以化学诱导蛋白质变性而沉析出为作用机理的三氯乙酸法有可能会造成过度测量下胶计量值。加热测试法则比之其他实验更接近造成自然瓶装储存条件中的不稳定蛋白沉淀析出的原理模式，其中6 h的加热测试比之30 min的加热测试更加适合于高气温地区使用，但也有潜在的过度测量问题。而本实验所用的酒精测量法无法给出准确下胶计量值，只可作为辅助测量方法，不能独立测量。

因实验期限限制，本实验无法给出在通常瓶储条件下，各方法所测量的下胶计量所能保证的蛋白质稳定时间期限，且未找到相关文献，所以有待于后续实验加以确认。

[1]李艳敏,赵树欣.不同酒类澄清剂的澄清机理与应用[J].中国酿造,2008(1)：1-4.

[2]POCOCK K F,SALAZAR F N,WATERS E J.The effect of bentonite fining at different stages of white winemaking on protein stability[J].Aust j grape wine res,2011,17：280-284.

[3]郭立安,阎哲,张晓楠,等.三氯乙酸对蛋白质结构稳定性的影响[J].第四军医大学学报,2001(22)：2113.

[4]TANFORD C.Protein denaturation[J].Advances in protein chemistry,1968,23：142.

[5]BERG H W,AKYOSHI M.Determination of protein stability in wine[J].Am j enol vitic,1961,12(3)：107-110.

[6]ESTERUELAS M,POINSAUT P,SIECZKOWSKI N,et al.comparison of methods for estimating protein stability in white wines[J].Am j enol vitic,2009,60(3)：302-311.

[7]李华.多糖对葡萄酒香气及酒石稳定的作用[J].酿酒,2000(5)：64-66.

[8]TOLAND T M,FUGELANG K C,MULLER C J.Methods for estimating protein in stability in white wines:a comparison[J].Am j enol vitic,1996,47(1)：111-112.

[9]BALDWIN G.Practical aspects of protein stabilisation[J].The Australian grapegrower&winemaker,1992(10)：11-12.

[10]NORDESTGAARD S J,COLBY C B,CHUAN Y P,et al.Bentonite lab fining trials with white wine[C]//Chemeca 2006:knowledge and innovation:conference proceedings,2006：395-400.

中国酒业协会白酒文化国际推广委员会9月13日在北京成立

本刊讯：据《中国酒业新闻》报道，2017年9月13日，“中国酒业协会白酒文化国际推广委员会”成立大会在北京正式召开。会议由中国酒业协会副理事长兼秘书长宋书玉主持，中国酒业协会理事长王延才、商务部流通产业促进中心主任路政闽、商务部流通产业促进中心统计与信息化处副处长王水平、贵州茅台酒股份有限公司销售公司董事长王崇林、五粮液股份有限公司副总经理朱忠玉、洋河股份(苏酒集团)副总经理张学谦、山西杏花村国贸投资有限责任公司董事长潘杰等20多位嘉宾与企业领导出席会议。

会议宣布成立中国酒业协会白酒文化国际推广委员会。与会专家与领导还结合企业的实际情况，对中国白酒“走出去”的进展情况及经验进行了沟通与交流，并就白酒“国际化”所面临的问题，以及如何“走出去”提出了工作建议。

据悉，为满足我国酒行业的发展需要，进一步加强协会组织建设，细化服务领域，提升协会服务职能，经中国酒业协会第五届理事会第五次(扩大)会议讨论通过，决定成立中国酒业协会白酒文化国际推广委员会，组织关联企业，推动中国白酒国际化，向世界传播中国白酒的文化底蕴和消费方式，深入分析国际酒类消费市场，建立白酒国际技术标准体系，探索中国白酒国际化的表达方式，促进白酒在国际市场、国际领域健康持续发展。（江源荐，黄筱鹂编辑）

来源：中国酒业新闻 2017-09-14

Comparison of the Methods for Determination of the Use Level of Bentonite in Kiwi Fruit Wine

GUO Jie1,2,3,SUN Zhongli1,2,3,CAI Haiyan1,2,3,YU Hang1,2,3,ZHANG Ying1,2,3and ZHANG Yi1,2,3
(1.Sichuan Food Fermentation Industry Research and Design Institute,Chengdu,Sichuan 611130;2.Sichuan Liquor Making Bio-technology&Application Key Laboratory,Chengdu,Sichuan 611130;3.National Engineering Technology Research Center of Solid-state Brewing,Luzhou,Sichuan 646000,China)

Hazes,gloss loss and precipitate often occur in fruit wine during shelf period due to physical and chemical reasons or microbial instability.Such phenomena will badly influence the sensory quality of fruit wine and its sales.In practice,bentonite is commonly used to eliminate the haze/precipitate induced by unstable proteins.In order to avoid excessive/insufficient use of bentonite,the methods including trechloroacetic acid test(TCA),heat test,and alcohol precipitation test were adopted respectively to evaluate the clarifying effects of bentonite.Through the comparison of the three methods,we found out that the use level of bentonite measured by TCA was higher than that measured by heat test;6 h heat test was recommended in high-temperature area instead of 30 min heat test;alcohol precipitation test could not determine the use level of bentonite in the experiment.

kiwi fruit wine;protein stability;clarification;bentonite

TS262.7；TS261.4

A

1001-9286（2017）10-0047-05

10.13746/j.njkj.2017242

四川省科技厅应用基础研究项目（2017JY0214）。

2017-09-11

郭杰（1973-），男，工程师，长期从事食品发酵工程相关工作。

孙中理（1987-），男，酒类研究学硕士，工程师，长期从事果酒、葡萄酒工艺研究工作。

优先数字出版时间：2017-09-21；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170921.1505.001.html。