一种快速提取质粒DNA的方法

●许朋 余兰 冯昆

一种快速提取质粒DNA的方法

●许朋1余兰1冯昆2

分子生物学技术发展迅猛，提取质粒DNA方法向着高通量、快速高效、广泛适用的方向发展。本实验采用二氧化硅修饰的磁珠设计了一种快速分离质粒DNA的试剂盒，并设计了多种引物，探索同一质粒DNA对两对引物，同一基因组DNA对两对引物进行PCR验证。结果表明：含磁性磁珠的试剂盒能够在10min内完成提取，产量较高；且样品对PCR无抑制作用，并适用于多种样品，应用此方法提取的DNA还可用于多重PCR。

提取；质粒

质粒是独立于染色体外并以超螺旋状态于细菌和酵母等多种生物中的环状的DNA分子。也是基因工程主要载体，在医学领域、分子生物学领域、免疫检验领域具有广泛的应用。碱裂解法、酚裂解法、煮沸法是传统的提取质粒DNA的方法，但传统的方法中使用了有多种有毒试剂、提取效率不稳定、步骤繁琐而且耗时长[6]。

随后发展了阴离子交换层析、疏水层析法和凝胶层析等方法，但是耗时且昂贵，不易实现自动化。因此寻求一种稳定、高效、高通量、安全环保、自动化DNA提取方法越来越重要。

随着纳米技术的发展，磁性纳米微球近几年来成为分子生物学领域瞩目的新星，其表面可以被多种活性基团包被修饰，表面积大，在磁场下的超顺磁作用等使得其应用广泛[9]。本实验针对质粒DNA的提取，探索采用二氧化硅包被的磁性磁珠，在传统的试剂盒原理上，通过提取体系的优化，探索并设计多种引物用于PCR验证并适用，建立了高效、快速、安全、普适的质粒DNA提取方法，为质粒的提取分离纯化提供进一步的依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌种：大肠杆菌的质粒pEGFP-N1来自实验室自存

1.2 实验试剂：盐酸胍、Rnase酶、胰蛋白胨、柠檬酸钠、乙酸钾、β一巯基乙醇、羧苄青霉素、吐温-20、无水乙醇、异丙醇、Tris碱、硼酸、酵母浸出液、溴化乙锭，LIris—HCl、RNase A、SDS、NaOH、KAc、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)

1.3 实验仪器：微型分光光度计Nanodrop ND—2000、凝胶成像系统、混合反应器、磁性分离架、恒温电热股风干燥箱、酸度计、水平电泳仪、PCR扩增仪、漩涡混合器、电热恒温振荡水槽、台式高速离心机

1.4 实验方法

1.4.1 质粒DNA提取

1）选取单菌落在3mL LB培养液（pH 7.0-7.2，0.5%酵母浸出液、1%胰蛋白胨、1%氯化钠）中并振荡过夜，用1.5ml在离心管集细菌培养液，于室温以12000rpm离心30s后，弃上清[1,4]。

2)细菌裂解：将细胞沉淀悬于100µL菌体悬浮液(10mmol/L EDTA，50mmol/LIris—HCl(pH 7.5)，50mg/m1RNase A)中，剧烈振荡使之充分混匀。接着加入150µL裂解液(裂解液：1%SDS、0.2mol/L NaOH)连续数次上下来回颠倒至澄清状溶液，于样品裂解液中加入300µL吸附液I(100mMTris 50mMEDTA，0.1M K+，4.2M盐酸胍，0.25MNa+，1/10V异丙醇，pH5.10）连续上下来回颠倒试管至混合均匀于室温12000rpm离心3min[5]；

3）吸附：吸取上清液置于洁净离心管内，取适量磁性纳米微球加入，上下来回5—10次颠倒试管充分混合使核酸吸附；

4）洗涤：磁性分离架上放上离心管，施加外磁场，在接近磁场一侧将吸附DNA的磁性微球富集从而分离出原溶液，加入70%的乙醇500µl，反复2次洗涤将染色体DNA和蛋白质等杂质除去；

5）洗脱：静置于2～3分钟将乙醇挥发，加入洗脱液100µL（0．5mmolEDTA、10mmolTris、pH=8.0）连续上下反复吹打沉淀将微球悬浮充分后置于室温3min洗脱DNA，得到纯化后的质粒DNA。

1.4.2 基因组DNA提取

100μL肺组织于试管，加入10μL混合酶工作液（10～40mg/mL的蛋白酶K，10～40mg/mL的溶菌酶），56℃水浴5min；加入750μL裂解液（Gu-Hcl的浓度为 3～8mol/L，Tris-Hcl的浓度为 10～30mmol/L，EDTA的浓度为1～10mmol/L、异丙醇的体积比为1/2～1/6，SDS为0.1～0.5%，Triton-100为0.5～2%，β-巯基乙醇为0.5～2%，Nacl的浓度为800mmol/L，pH6.8的柠檬酸钠浓度为200mmol/L）以及磁性纳米微球，连续5-10次上下来回颠倒试管以充分混合，置室温3min后将上清用磁分离架分离弃去；用800μL洗涤液（800mmol/LLicl，100mmol/LNacl，50mmol/LMOPS，乙醇的体积比为60%，其中乙醇的pH=7.0）洗2次，分离磁珠弃上清；用1000μL漂洗液（70%乙醇）漂洗2次再次分离磁珠弃上清；室温放置3min，挥干乙醇，加入100μL洗脱液（0.5mmol/LEDTA，10mmol/LTris-Hcl，其中Tris-Hcl的pH=8.0）上下吹打沉淀，充分将微球悬浮，静置室温3min，得到纯化后的基因组DNA。

1.4.3 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖0.4g于锥形瓶，加50ml l× TBE，加热使琼脂糖溶解，取出后置冷，加入3µL EB，混匀，排气泡倒入模具中并插入样品梳，冷却凝固撤梳子，将凝胶放入电泳槽中。将得到的样品提取液取5µL与lµL Loading buffer混匀后，分别加入点样孔中。另外取3µl marker，加入点样孔中。打开电源，调节电压为110V，电泳30min。30min后，取出凝胶，拍照[2,3,7,8]。

1.4.4 PCR

1.4.4.1 PCR引物：Forward Primer CTGGACACTTGGACATGGTCA

Reverse Primer CATAGCCAGAATTGAAGCCCA

Forward Primer AGTCACCACGGTTCATGGAAA

Reverse Primer CATGCTGGCTCCAGTATAATTGA

1.4.4.2 PCR体系：体系如下表1（：以25μl为例）

表1 25μlPCR体系

1.4.4.3 PCR反应条件：三步法PCR，98℃ 10 sec.，60℃ ＊ 30 sec.，72℃ 1 min，30个循环，扩增产物用1%的琼脂凝胶电泳检测。

2 结果与分析

2.1 质粒DNA的电泳检测结果

利用该磁性磁珠试剂盒提取质粒DNA结果如图1所示，结果显示，该方法提取的质粒DNA条带明显，纯度高，条带显示清晰，即无蛋白质和RNA污染，该方法纯化所得质粒DNA可用于酶切、PCR等实验。

2.2 同一质粒DNA对两对引物

为了检验样品纯度以及对PCR的作用。将同一样品应用于两对引物进行PCR验证。由图2、3，结果表明，提取的质粒DNA对于引物一、引物二都能够扩增。引物一扩增后的条带大小在100-250bp。引物二扩增后的条带大小在400-500bp之间。同一样品用不同引物均能扩增出来，表明该提取方法得到的产物，无PCR抑制作用，适用广泛。

2.3 同一基因组DNA对两对引物

利用磁性磁珠法提取的基因组DNA用于PCR扩增，由图4得到，不同引物均能成功地扩增，扩增条带大小400-500bb，且清晰可见。此结果表明，该磁珠提取法提取的基因组DNA对于PCR无抑制作用。

3 讨论

蛋白质、细胞、多肽以及核酸等生物分子的分离、纯化、精制在医学领域和生物学领域的应用尤为重要，分离纯化技术的发展直接影响着生物学的发展水平。本实验所设计的磁性磁珠法质粒DNA提取试剂盒与目前市售的多种质粒DNA提取试剂盒相比较，能够解决目前存在的耗时长、试剂毒性大、产率不稳定等问题，再将其比较硅胶膜离心柱及同类型磁性分离试剂盒，有如下的特点：首先，操作简便，提取高效，实验在一个离心管内操作完成，减少了相互污染，减少了产物丢失，所得质粒DNA产物纯度高，无RNA以及蛋白质污染，产物可应用于各种分子生物学实验。其次，耗时短，能够在室温10min内完成提取，不使用有毒试剂，操作流程简略、易于实现自动化、安全化。第三，价格低廉，实验仪器简单，试剂均为国产，且磁性磁珠为实验室合成，缓冲液自己设计。第四，本试剂盒对多种样品均适用，且多种样品对于两种引物无PCR抑制，适用广泛。

（作者单位：1遵义医学院,2遵义医学院珠海校区,珠海市中药基础及应用研究重点实验室）

[1]郭旭东,毛舒燕,侯冬霞,旭日干.一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法[J].生物工程学报,2007,(01)：176-178.

[2]张怡,刘坤,曹鹏,魏森,韦丹丹,杜建,李鹏坤,李成伟.一种快速高效提取酵母质粒的方法[J].食品与生物技术学报,2013,32(11)：1194-1198.

[3]何冬兰,余金龙,邵坤彦,邵洁云.一种快速提取质粒DNA鉴别重组克隆的方法[J].中南民族大学学报(自然科学版),2011,30(01)：37-38.

[4]王建安,刘延娜,司华新,楚雍烈,范桂香.一种快速、简便的质粒DNA提取方法[J].西安医科大学学报(中文版),1995,(04)：363.

[5]张素娥,张潇月,刘辉,张显忠.CTAB法提取质粒DNA的探讨[J].泰山医学院学报,2017,38(03)：287-289.

[6]熊福银,林艳丽,吴晓洁,周艳荣,邓继先,陈红星.一种快速、有效、经济的提取酵母质粒的方法[J].生物技术通讯,2009,20(03)：386-387.

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[8]陈月仙,赵阳.一种快速提取致癌农杆菌(Agrobecteriumtumefaciens)Ti质粒的方法[J].北京大学学报(自然科学版),1986,(06)：111-116.

[9]单志.多功能纳米磁性粒子的合成及其在细胞富集和质粒DNA纯化中的应用研究[D].成都：四川农业大学,2010.

A Rapid Method for Preparation of Plasmid DNA

XuPeng1YuLan1＊FengKun2＊
1.Zunyi Medical College, Zunyi, 563000 2.Zhuhai Campus of Zunyi Medical College Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research of Traditional Chinese Medicines, Zhuhai, 519000

the fast development of molecular biology techniques, the method of extraction of plasmid DNA toward high flux are widely used in the direction of development and efficiently This experiment adopts the silicon dioxide modified magnetic beads to design a kind of quick separation of plasmid DNA kit, and designed a variety of primers, explore the same plasmid DNA of two pairs of primers, the same genome DNA of two pairs of primers for PCR test results show that the kits containing magnetic beads can finish extracted in 10 min, yield is higher; The sample has no inhibitory effect on PCR and is applicable to multiple samples. The DNA extracted from this method can also be used in multiple PCR.

extraction; plasmid

余兰 冯昆

许朋，男，研究生；余兰，女，博士，硕士生导师，研究方向为天然产物分离纯化及其活性研究；冯昆，男，博士，硕士生导师，研究方向为微生物与生化药学。