小鼠CD4+T细胞外泌体分离及鉴定

张伟鑫，曾 仲

(昆明医科大学第一附属医院器官移植中心，昆明 650000)

研究报告

小鼠CD4+T细胞外泌体分离及鉴定

张伟鑫，曾 仲*

(昆明医科大学第一附属医院器官移植中心，昆明 650000)

目的探讨CD4+T细胞是否具有分泌外泌体的能力，以及CD4+T细胞外泌体参与炎症及肿瘤免疫过程的可能。方法应用断颈处死的方法取出小鼠的脾脏，用磁珠分选的方法从小鼠脾脏细胞中分选出CD4+T细胞，并尝试从培养基上清液中提取CD4+T细胞的外泌体，在透射电镜下观察，后用PCR技术分析miR-23a、miR-214的表达情况。结果在透射电镜下能够观察到提取出的CD4+T细胞外泌体，且用PCR技术能检测到小鼠CD4+T细胞外泌体中miR-23a、miR-214这两个炎症及肿瘤相关的miRNA的表达。结论小鼠CD4+T细胞有分泌外泌体的能力，且为CD4+T细胞外泌体参与炎症及肿瘤相关过程提供了可能。

CD4+T细胞；外泌体；分离；鉴定；miRNA

外泌体(exosomes)是可由各种细胞脱落释放的大小均一的直径约为30～150 nm的脂质双分子层结构的囊泡，其外面的脂质双分子层膜可保护它内含物不受降解。其囊泡内含有脂质、蛋白质、mRNA、miRNA、siRNA等多种遗传物质[1]。自1985年Pan等[2]人首次在成熟哺乳动物的网织红细胞中观察到后，众多学者研究发现几乎所有细胞都可产生外泌体，其广泛存在于血液、尿液、腹水

等体液中[3]。外泌体参与着人体许多重要的生理及病理过程,它在细胞的通讯及迁移、血管新生、炎

症及免疫反应和肿瘤细胞的生长及迁徙浸润等方面有着极为重要的作用[4]，因此外泌体的研究引起了众多的关注。本文就小鼠CD4+T细胞是否能够分泌外泌体进行验证从而探寻CD4+T细胞外泌体参与炎症及肿瘤相关过程提供可能。

1 材料和方法

1.1实验动物

SPF级雄性BALB/c小鼠，体重20～22 g，6～8周龄，购自昆明医学院(实验动物中心)[SCXK(滇)2015-0008]，小鼠的组织取材于中国科学院昆明动物研究所动物实验设施内进行[SYXK(滇)2013-0004]。并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2主要试剂

小鼠淋巴细胞分离液(达科为公司)免疫磁珠分选仪(Miltenyi Biotec公司)；流式细胞仪(BD Biosciences公司)；小鼠CD4+T细胞磁珠分选试剂盒(Miltenyi Biotec公司)；培养细胞Exosome提取试剂盒(唯辉公司)；Exosome透射电镜分析试剂盒(唯辉公司)；RPMI1640培养液和青霉素、链霉素双抗(Hyclone公司)；PBS磷酸盐缓冲液(Hyclone公司)。

1.3实验方法

1.3.1 小鼠脾脏淋巴细胞悬液的制备

将小鼠断颈处死后浸泡于75%的乙醇中，于超净台取出小鼠脾脏置于细胞筛网(70 μm)中，将细胞筛网置于60 mm细胞培养皿中，加入5 mL小鼠淋巴细胞分离液，仔细研磨后将悬有脾脏细胞的分离液转移到15 mL的离心管中，并小心覆盖上500 μL的RPMI1640培养基，室温下2600 r/min离心30 min(需设置较慢的加速度和减速度)。后小心吸出中间的淋巴细胞层，加入10 mL的RMPI1640培养基，颠倒洗涤，于室温下1600 r/min离心10 min，弃去上清液，收集细胞并计数。

1.3.2 CD4+T细胞悬液的制备

将得到的小鼠脾脏淋巴细胞悬浮于PBS磷酸盐缓冲液中并调整细胞浓度为107个/90 μL。添加美天旎CD4(L3T4)磁性微珠并混匀4℃放置15 min，后加入PBS磷酸盐缓冲液冲洗并1600 r/min离心10 min，弃去上清液，加入PBS磷酸盐缓冲液重新悬浮细胞并调整浓度为108个/500 μL，将细胞加入已经冲洗好的美天旎MS型号分选柱中，待柱内细胞悬液流干后再加入500 μL PBS缓冲液冲洗3次，取下分选柱，放置在15 mL离心管上并加入1 mL缓冲液用柱塞冲洗出磁性标记细胞。

1.3.3 CD4+T细胞纯度检测

取上述经磁珠分选后的细胞于室温下1600 r/min离心10 min后，弃去上清液，加入PBS磷酸盐缓冲液调节细胞浓度为106/mL吹打混匀，取80 μL的细胞悬液，置于200 μL的离心管中，加入FITC anti-mouse CD3e和PE anti-mouse CD4各10 μL混匀后室温避光放置30 min，之后上流式细胞仪进行检测分析。

1.3.4 CD4+T细胞外泌体的提取

将细胞室温下1600 r/min离心8 min后弃去上清液，用无血清的RMPI1640培养基调整CD4+T淋巴细胞浓度为2×107个/mL，在24孔细胞培养板中每孔加入1 mL悬浮好的CD4+T淋巴细胞，置于细胞培养箱中饥饿处理细胞48 h后收集2 mL细胞培养基，于4℃下4200 r/min离心10 min去除细胞和细胞碎片，转移2 mL上清液到玻璃管中并加入现配好的exosome提取液，涡旋混匀并于4℃中静置30 min，可见玻璃管中出现明显分层，吸出管中的exosome层置于1.5 mL微量离心管中9000 r/min离心3 min后弃去管中上层和底层再将中间的exosome层转移到0.5 mL微量离心管中9000 r/min离心3 min后弃去管中上层和底层只留下中间的exosome层，将管盖打开晾干5 min后加入80 μL PBS缓冲液到微量离心管中并用移液枪剧烈吹打后在水平摇床上高速摇动管子10 min使exosome层再次悬浮，将管子9000 r/min离心5 min，转移上清液到试剂盒提供的过滤柱中，将柱子4200 r/min离心5 min，收集到的液体即为exosome悬液。

1.3.5 CD4+T细胞外泌体的电镜观察

在干净的Parafilm膜上滴10 μL exosome悬液，取一张exosome透射电镜分析试剂盒中提供的EM网，将其涂层面朝下贴在exosome悬液表面让其在干燥环境中吸收10 min。用镊子将EM网(涂层面朝下)转移到清洗缓冲液中清洗30 s后再重复清洗一次。于干净的封口膜上，滴10 μL的EM溶液，转移EM网(涂层面朝下)到EM溶液中静置10 min后，转移EM网到清洗缓冲液中清洗30 s后再重复清洗一次。转移EM网到滤纸上(涂层面朝上)，室温下风干过夜。将EM网置于透射电镜下观察。

1.3.6 PCR技术检测相关的miRNA的表达

利用PCR技术检测miR-23a、miR-214这两个炎症及肿瘤相关的miRNA其在小鼠CD4+T细胞外泌体中的表达。(见表1)

表1 引物列表

2 结果

2.1CD4+T纯度检测

从小鼠脾脏细胞中利用磁珠分选的方法分离获得的CD4+T细胞纯度为(90.1±5.8)%可以用于后续实验(见图1)。

图1 CD4+T细胞纯度检测结果Fig.1 CD4+T cells purity test results

2.2CD4+T细胞外泌体的电镜观察

将CD4+T细胞经饥饿处理后通过分离与纯化其上清液中的外泌体，在透射电镜下观察到小鼠CD4+T细胞外泌体呈圆形或椭圆形，其大小不一，直径约在80 nm左右，可见有明显的膜性结构，其腔内为低电子密度成分(见图2)。

图2 透射电镜下观察到的CD4+T细胞外泌体Fig.2 CD4+T cell exosomes observed under TEM

2.3利用PCR技术检测特定miRNA的表达

利用PCR技术能检测到外泌体中miR-23a、miR-214这2个miRNA的表达。在普通PCR电泳中在约100 bp处，5个样品都出现条带，由于产物大小和引物二聚体大小比较接近，因此从电泳图上看起来是一条单一的条带(见图3)。而在Real Time PCR中溶解曲线上出现不单一峰，说明除了目标miRNA外可能存在其他产物。但是本实验采用的方法为茎环法，其特异性相对较高。产物不单一，存在的可能引物二聚体，因此，胶图和曲线二者结果基本吻合。(见图4)

注：(1)为引物mmu-miR-23-3p-F/mmu-miR-R组；(2)为引物mmu-miR-23-5p-F/mmu-miR-R组；(3)为引物mmu-miR-214-5p-F/mmu-miR-R组；(4)为引物mmu-miR-214-3p-F/mmu-miR-R组；(5)为内参U6-F/U6-R组。图3 普通PCR结果Note.(1)Primer mmu-miR-23-3p-F/mmu-miR-R group；(2)Primer mmu-miR-23-5p-F/mmu-miR-R group；(3)Primer mmu-miR-214-5p-F/mmu-miR-R group；(4)Primer mmu-miR-214-3p-F/mmu-miR-R group；(5)Internal reference U6-F/U6-R group.Fig.3 Ordinary PCR electrophoresis results

3 讨论

外泌体是由细胞内的多泡体与胞浆膜融合然后释放到胞外的一种脂质双分子层结构的囊泡, 直径约30～150 nm, 其广泛存在于各种体液中如血液、尿液、唾液等，其囊泡内含有脂质、蛋白质、mRNA、miRNA、siRNA等多种遗传物质[5，6]。外泌体被细胞释放入外环境后，可以通过受体介导、直接弥散、内吞作用等方式来进入靶细胞，由于其内含有生物活性脂质、蛋白、核酸等，故其可以向受体细胞传递各种遗传信息进而发挥各种生物学功能，从而影响靶细胞细胞的生长状况，进而介导疾病的发生和发展[7]。这些外泌体所携带的RNA被统称为外泌体来源RNA(exosome shuttle RNA，esRNA)。已经有研究发现EsRNA拥有相对稳定的特性，能在一定程度上代表其母细胞的miRNA水平。因此，esRNA拥有作为分子诊断标记和靶向治疗的潜力[8]。在肿瘤相关方面esRNA有着诱导肿瘤细胞的侵袭性以及保持肿瘤细胞的致瘤性的能力[9]。

注：(A)熔解曲线；(B)荧光曲线；(C)扩增曲线。图4 Real Time PCR结果Note.(A)Melting curve；(B)Fluorescence curve；(C)Amplification curve.Fig.4 Real-time PCR results

本实验已经证实了小鼠CD4+T细胞分泌的外泌体中能够检测到miR-23a、miR-214这2个miRNA的表达。对于miRNA-23a，已有研究证明其参与着炎症反应以及肿瘤相关的过程。研究学者Li等[10]研究了临床肝炎患者血清中的miRNA表达谱后发现，乙型肝炎患者血清中miR-23a的表达明显升高。还有研究学者研究发现，在牙周炎患者其牙龈组织中的miR-23a的表达高于健康者[11，12]，提示了miR-23a极有可能与炎症反应的发生以及发展有关。miRNA-23a在肿瘤相关方面，已有研究显示其与肿瘤的发生、发展具有着非常密切的关系，其一般扮演致癌基因的作用，参与着多种癌症的发生、发展过程。如：有研究学者发现， miR-23a能够直接地靶向抑制转移抑制因子1蛋白的表达，进而能够促进结肠癌细胞的生长以及侵袭转移的能力。其临床研究还说明miR-23a在结肠癌中的表达上调，并且随着临床分期的演进以及浸润深度的增加而增加，其有可能成为肠黏膜恶性转变以及结肠癌发生浸润转移的重要的生物学标志[13，14]。而对于miR-214，近几年的研究发现发现，miR-214在多种恶性肿瘤中均有异常表达，但其在不同肿瘤中的表达情况却不尽相同，具有一定的肿瘤特异性。有研究学者Zhang等[15]人研究发现，miR-214在胰腺癌中呈现高表达，其能够促进胰腺癌细胞的生存并能降低肿瘤细胞对吉西他滨的敏感性。还有Yang等[16]人研究发现：miR-214可以促进卵巢癌细胞的存活，并能够降低对化疗药物顺铂的敏感性。而另外有一些学者报道：miR-214在肿瘤中则呈低表达，如研究显示，在宫颈癌细胞系Hela以及Caski细胞中，TFAM蛋白的表达量明显升高，但miR-214的表达量却呈现明显的下降。而当在这两种细胞中上调miR-214的表达，能够明显的抑制宫颈癌细胞的增殖及细胞周期进展，进一步的研究显示：TFAM是miR-214的靶基因之一，而且miR-214可以通过降低TFAM的表达来达到延缓肿瘤发展，并增加宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性的目的[17]。

CD4+T细胞不是功能单一的一类细胞,它是一群功能复杂的细胞群。其各亚群在细胞免疫反应都有着极为重要的作用。其不仅能辅助细胞毒性T细胞,还可以协助NK细胞清除和杀灭肿瘤，甚至还有着不依赖于CD8+T细胞的肿瘤杀伤作用，它在机体抗肿瘤免疫中有着重大的意义[18，19]。在现阶段在临床研究中，已经有学者研究得出输注CD4+T细胞,可以有效防止接种了血液或实体肿瘤细胞的动物发病[20]。

本实验已经证实了CD4+T细胞具有着分泌外泌体的能力，且在其分泌的外泌体中检测到miR-23a、miR-214，这两个免疫及肿瘤相关的miRNA的表达，而恰恰CD4+T细胞的功能也与炎症及肿瘤相关，是否CD4+T细胞在执行其免疫及肿瘤相关的功能时有着miR-23a、miR-214的参与？值得我们去深入研究。本实验为CD4+T细胞外泌体参与CD4+T细胞执行其炎症及肿瘤过程提供了可能，并且CD4+T细胞是一群功能较为复杂的细胞群，其分泌的外泌体必定是多种多样的，其中所含的miRNA必定更为复杂，这些miRNA是否能发挥作用？怎样去发挥作用？我们依旧不甚清楚，这值得广大学者们深入探索。

总之，对外泌体的研究国内依旧处于初级阶段，对外泌体的研究还有着诸多的困难，对于外泌体发挥作用的具体机制，也需进一步的探究。相信随着科技的发展以及人们对外泌体认识的日益加深，外泌体中蕴含的丰富信息将会被人们所了解并运用到对疾病的治疗中去。

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IsolationandidentificationofexosomesofCD4+Tcellsinmice

ZHANG Wei-xin， ZENG Zhong*

(Organ Transplantation Center,The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650000，China)

ObjectiveTo explore whether CD4+T cells in mice can secrete exosomes and the possibility of exosomes to participate in the inflammation and immune response process.MethodsSpleen samples were taken from mice, and CD4+T cells were isolated from the spleen tissue using magnetic bead separation method. Exosomes of CD4+T cells were extracted from the supernatant and observed under transmission electron microscope. PCR assay was used to detect the expression of miR-23a and miR-214.ResultsExosomes were observed under elecron microscope,and the expression of miR-23a and miR-214 were detected by PCR assay.ConclusionsCD4+T cells in mice can secrete exosomes,which offer possibility to participate in the inflammation and immune response.

CD4+T cells; Exosome; Isolation; Identication; MiRNA

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0060-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.012

2017-02-28

云南省卫生科技计划基金资助项目(2014NS155)。

张伟鑫(1990-)，男，硕士研究生，主要从事肝胆外科疾病的临床研究。E-mail: 815564969@qq.com

曾仲(1967-)，男，博士，主任医师，主要从事肝胆外科疾病的临床研究。E-mail: zzong@medmail.com.cn