松花粉辅助紫杉醇联合铂类化疗的增效减毒作用

赵学友，巩 萍，孙 铜，马玉奎

(1.山东省临朐县人民医院，山东 临朐 262600； 2.山东省食品药品检验研究院，济南 250101； 3.山东省药学科学院，济南 250100)

研究报告

松花粉辅助紫杉醇联合铂类化疗的增效减毒作用

赵学友1，巩 萍1，孙 铜2，马玉奎3*

(1.山东省临朐县人民医院，山东 临朐 262600； 2.山东省食品药品检验研究院，济南 250101； 3.山东省药学科学院，济南 250100)

目的研究松花粉对紫杉醇联合铂类(paclitaxel and cisplatin, TP)方案化疗有无减毒和增效作用。方法取人肺癌H460细胞株制备的移植瘤裸鼠48只，按瘤体积均衡原则分为模型组、松花粉600、300、150 mg/kg三个剂量+TP方案化疗组、单用TP方案化疗组、单用松花粉600、300、150 mg/kg三个单剂量组，每组6只。各组给予相应的药物后以裸鼠的体重、进食量、抑瘤率、血液学和肝肾功能等为评价指标，全面评价松花粉对TP化疗方案有无增效和减毒作用。结果模型动物给予TP方案化疗的同时灌胃给予松花粉(150、300、600 mg/kg)可明显提高单用TP化疗方案的抑瘤率，抑制化疗药物引起的体重减轻和摄食量的减少、抑制化疗引起的白细胞降低和肝肾功能的损伤。结论TP方案化疗的同时给予松花粉具有明显的增效减毒作用。

松花粉；增效；减毒；肺癌

松花粉(Pini Pollen)药名松花、松黄，最早记载于唐代的《新修本草》。松花粉是我国传统药材，可药食兼用的花粉品种，在我国具有悠久的药用历史。《神农本草经》和《本草纲目》中均记载其“气味甘平无毒”，具有润心肺、益气、利小便、消瘀血等功效，亦可用于酿酒。松花粉富含蛋白质、磷脂、矿物质和多种维生素和微量元素等营养物质[1]。现代药理研究证明，松花粉具有降脂、延缓衰老、美容养颜、保肝、降糖、提高机体免疫力等众多功效[2]。 尽管研究证明众多中药均具有抗肿瘤作用，但单味中药用于抗肿瘤临床上几乎没有确切疗效，临床一般多辅助化疗药物应用[3]。故本文采用人肺癌H460裸鼠移植瘤模型初步考察了松花粉对TP方案化疗的增效和减毒作用，为松花粉进一步研究和开发利用提供参考。

1 材料和方法

1.1实验动物及瘤珠

BALB/c裸鼠，雄性，SPF级，4周龄，15～17 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]提供。饲养于山东省药学科学院独立送风IVC笼具中[SYXK(鲁) 2010-0005]。室温20℃ ～23℃，相对湿度 40% ～60%。本实验经过山东省药学科学院新药评价中心实验动物使用与管理委员会审查，编号为IACUC-2015068。人肺癌H460细胞系，济南天长商贸有限公司提供。

1.2主要试剂与仪器

松花粉(批号：14010412，烟台新时代健康产业有限公司)；紫杉醇注射液(TAX，批号：E1400520，江苏奥赛康药业股份有限公司)；注射用顺铂(CDDP，批号：140728，上海新百合药业股份有限公司)。

Hemavet 950型全自动血球计数仪(Drew Scientific公司)；日立7180全自动生化分析仪(日本株式会社日立高新技术)；BPN-50CH(UV)二氧化碳培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；XSP-18C型倒置生物显微镜(上海巴拓仪器有限公司)；电子数显卡尺(深圳市格雷创科技有限公司)。

1.3实验方法

1.3.1 裸鼠移植瘤模型建立及动物分组

常规传代培养人肺癌H460细胞，收集细胞悬液后调整细胞数为每毫升1.0×108～2.0×108个细胞。在无菌条件下将肿瘤细胞接种于裸鼠右腋皮下，每只0.1 mL。接种后定期测量肿瘤长径、宽径和高，计算瘤体积(V=3. 14×宽径×长径×高/6)[4]，当肿瘤体积为150～300 mm3时，按瘤体积均衡原则分为模型组、松花粉600、300、150 mg/kg三个剂量+TP方案化疗组、单用TP方案化疗组、单用松花粉600、300、150 mg/kg三个单剂量组，每组6只。

1.3.2 分组后给药

松花粉各剂量组裸鼠每天灌胃1次，给予相应剂量的药物溶液，连续给药21 d；TP方案化疗组于分组后第8天和16天按照16 mg/kg剂量各腹腔注射1次TAX，第10、12和14天按照6.7 mg/kg剂量各腹腔注射1次CDDP。松花粉+TP方案化疗组在给予TP方案化疗的基础上给予松花粉；模型组灌胃给予等体积的纯水和腹腔注射等体积的0.9%氯化钠注射液。

1.3.3 结果检测和评价

体重和饲料消耗量每3 d称量1次，21 d药后3 h戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉采血，检测主要血液学指标：红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白 (HB)和肝肾功能指标：谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(CR)。采血后取每只动物的瘤块并称瘤重，按下面公式计算出抑瘤率和q值[5,6]。

肿瘤抑制率=(A-B)/A×100%，B为药物组平均瘤重，A为模型组平均瘤重。

q值=E(ab)/[Ea+(1-Ea) ×Eb]，E(ab)为两种药物合用的肿瘤抑制率，Ea、Eb为两种药物单用的肿瘤抑制率，q大于0.85提示两种药物合用有协同作用。

1.4统计学方法

2 结果

2.1松花粉对化疗裸鼠摄食量的影响

裸鼠给予化疗药物后摄食量减少，而同时给予松花粉后，裸鼠摄食量随着给药时间延长逐渐恢复，其中给药21 d后化疗和松花粉300、600 mg/kg合用组裸鼠的摄食量与模型组基本一致。见表1。

2.2松花粉对化疗裸鼠体重的影响

TP方案化疗后裸鼠体重逐渐减轻，自12 d开始体重明显低于模型组(P﹤0.05)，而同时给予松花粉后，裸鼠体重随给药时间延长逐渐恢复，给药21 d后体重明显高于TP化疗组(P﹤0.05)，而与模型组体重基本一致。结果见表2。

2.3松花粉对化疗药物的增效作用

与模型组比较，松花粉和TP方案化疗合用后瘤重明显减轻，抑瘤率明显高于化疗或松花粉单用组，其中松花粉300、600 mg/kg和化疗合用后q值大于0.85，说明松花粉在300 mg/kg以上剂量时可明显增强TP方案化疗的抗肿瘤作用。结果见表3。

表1 松花粉对裸鼠摄食量的影响(n=6)

Tab.2Effects of Pini Pollen on body weight of the model nude mice

组 别Groups剂量/mg/kgDoses体重/g Bodyweight0d6d12d18d21d模型Model—232±17246±20248±17259±19263±17紫杉醇+顺铂Paclitaxel+Cisplatin16+67231±19232±18218±19∗212±18∗210±21∗松花粉+紫杉醇+顺铂PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67235±16233±16224±12237±21#242±21#300+16+67230±22229±19222±16234±20#239±19#150+16+67236±20230±18219±16223±15234±14#

注：与模型组比较,*P﹤0.05；与TP组比较,#P﹤0.05。

Note.*P﹤0.05,vs the model group；#P﹤0.05, vs the TP group.

Tab.3Synergistic effects of Pini Pollen on chemotherapy in the model nude mice

组 别Groups剂量/mg/kgDoses瘤重/gTumorweight抑瘤率/%Tumorinhibitionrateq值qvalue模型Model—152±043 ——紫杉醇+顺铂Paclitaxel+Cisplatin16+67070±016∗539—松花粉PiniPollen600098±016∗##355—300108±026#289—150112±032#263—松花粉+紫杉醇+顺铂PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67038±017∗∗750107300+16+67056±026∗∗632094150+16+67068±015∗553084

注：与模型组比较,*P﹤0.05,**P﹤0.01; 与松花粉+TP组比较,#P﹤0.05,##P﹤0.01。

Note.*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs the model group；#P﹤0.05,##P﹤0.01 vs the Pini Pollen plus TP group.

Tab.4Attenuation effects of Pini Pollen on hematological and blood biochemical toxicity caused by chemotherapy in the model nude mice

组 别Groups剂量/mg/kgDosesWBC/109/LRBC/1012/LHB/g/LALT/U/LAST/U/LCR/μmol/LBUN/mmol/L模型Model—731±099101±15136±21691±1781487±194300±3569±12紫杉醇+顺铂Paclitaxel+Cisplatin16+67451±067∗∗91±09120±221250±299∗2211±324∗∗542±40∗∗107±20∗松花粉+紫杉醇+顺铂PiniPollen+Paclitaxel+Cisplatin600+16+67688±195#104±20126±21791±211#1623±215#351±76#79±11#300+16+67631±099#98±16113±19855±178#1802±243#419±68#83±12#150+16+67560±122∗100±20122±10982±254∗1972±310∗461±64∗∗87±21

注：与模型组比较,*P﹤0.05,**P﹤0.01；与TP化疗药物组比较,#P﹤0.05。

Note.*P﹤0.05,**P﹤0.01, vs the model group；#P﹤0.05, vs the TP group.

2.4松花粉对化疗引起的血液学和血液生化学毒性减毒作用

与模型组比较，裸鼠WBC数量化疗后明显减少，血清中ALT、AST、CR和BUN含量明显升高，与单用化疗药物组比较，同时给予松花粉300、600 mg/kg后裸鼠WBC数量明显增多，血清中ALT、AST、CR和BUN含量明显降低(P﹤0.05)，说明松花粉在300 mg/kg以上剂量可明显抑制TP方案化疗药物引起的白细胞减少和肝肾功能损伤。各个剂量对RBC和HB无明显影响。结果见表4。

3 讨论

我国恶性肿瘤的发病率和死亡率逐年上升，我国每年新发肿瘤病例300多万，肿瘤病人死亡人数占全球的四分之一左右，已成人类死亡的主要原因[7]。临床上根据肿瘤的不同生长部位、不同病理类型、不同分期、患者的具体情况等会选择化疗、放疗、手术治疗以及中医药治疗等不同的治疗方式。其中，化疗时最常用的治疗方式，但多数化疗药物存在选择性差，毒副作用大，容易耐药等缺陷，严重制约着化疗的效果。而中医药治疗具有多靶点和多环节效应以及副作用小等化药不具有的优势，但也存在诸如治疗的肿瘤和疗效有限、作用机制不明确等众多缺陷，故临床上中药多与化疗药物合用，通过增强机体免疫力、活血化瘀、扶正驱邪、补气养血、清热解毒、调理脏腑等多个方面增强化疗药物疗效的同时降低毒副反应，改善肿瘤患者的生活状态，提高肿瘤患者化疗的耐受性等[8,9]。

选择合适的实验动物模型是新药药效评价的重要一环，目前抗肿瘤药物的增效减毒作用研究多采用S180腹水癌小鼠模型，研究对于环磷酰胺等单个化疗药物的辅助作用，但此模型与临床实际应用存在较大差异，例如肿瘤细胞来源为鼠源性而非人源性瘤株，临床化疗一般不会单个药物而多采用多种化疗药物联合应用等。因此本文采用了人源性的H460非小细胞肺癌瘤珠制备裸鼠移植瘤模型，给予非小细胞肺癌国际治疗指南中推荐的TP标准化疗方案，选择抑瘤率作为增效指标，化疗最常见的食欲不振、体重减轻、白细胞减少和肝肾功能损伤作为减毒指标，初步模拟临床治疗现状来研究松花粉的增效减毒作用。

本实验研究结果证明，裸鼠给予TP方案化疗后出现了体重减轻、进食量减少、WBC减少、肝肾功能受损等临床肿瘤病人化疗后最容易出现的不良反应，说明此模型复制成功，能够较好地模拟临床实际。化疗的同时灌胃给予松花粉后，不良反应明显减轻，体重和进食量随着给药次数增多逐渐恢复正常。与TP方案化疗组小鼠比较，合用松花粉21d时检测WBC数量明显增多，血清中AST、ALT、CR、BUN含量明显降低，说明松花粉对血液系统和肝肾功能具有明显保护作用。抑瘤效果显示，TP方案化疗和松花粉合用后，与单纯TP方案化疗相比，对H460裸鼠移植瘤的抑瘤效果显著增强。本实验结果初步证明，松花粉对化疗药物具有明显的增效和减毒作用，其作用可能与松花粉具有抗氧化、保肝、提高免疫力、抗肿瘤作用有关[2,10]，其确切的作用机制仍有待于进一步研究。

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SynergismandattenuationeffectsofPiniPollenonpaclitaxelandcisplatinechemotherapy

ZHAO Xue-you1， GONG Ping1， SUN Tong2， MA Yu-kui3*

(1.People’s Hospital of Linqu County, Linqu 262600，China； 2.Shandong Institute for Food and Drug Control, Jinan 250101； 3.Shandong Pharmaceutical Academy, Jinan 250100)

ObjectiveTo investigate the synergism and attenuation effects of Pini Pollen on paclitaxel and cisplatin (TP) chemotherapy in model mice.MethodsForty-eight model nude mice with H456 cell line xenograft were divided into 8 groups: model group, TP chemotherapy group, Pini Pollen (150, 300 and 600 mg/kg)group and TP chemotherapy plus Pini Pollen (150, 300 and 600 mg/kg)group. The tumor inhibition rates, body weight, food intake, hematology and blood biochemistry indexes were selected to evaluate the synergism and attenuation effects of intragastric administration of Pini Pollen (150,300,600 mg/kg) on TP chemotherapy.ResultsCompared with the TP chemotherapy group, the tumor inhibition rates, body weight, food intake, white blood cell count were increased and liver and kidney function damage were alleviated significantly in the TP chemotherapy plus Pini Pollen groups.ConclusionsPini Pollen has a significant synergism and attenuation effects on TP chemotherapy.

Pini Pollen; Synergism; Attenuation; Lung Cancer

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0047-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.009

2017-02-06

山东省自主创新及成果转化专项(2014ZZCX02104)。

赵学友(1975-)，男，主管药师，本科， 研究方向：临床药学。E-mail: yaoliduli@163.com

马玉奎 (1975-)，男，主任药师，博士，研究方向：新药药理毒理评价。 E-mail: yukuima@sina.com